Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Şekil 1 piruvat / malat, süksinat / rotenone, palmitoil karnitin / malat ve glutamat / malat deneyler (Kavrama Tahliller) için oksijen tüketimi oranlarını (OCR) temsil eder. Bu tahlil iz, Oksijen Tüketimi Oranı veya OCR, vs zaman olarak gösterilir arka correceted edilir ve noktadan noktaya oranları olarak görüntülenir. Her panel Şans ve Williams 14 tarafından açıklandığı gibi farklı mitokondriyal devletlerde oksijen tüketimini gösterir. Birinci panel, ADP enjeksiyonundan sonra bazal oksijen tüketimi ya da State 2. ikinci panel, temsil eden oligomycin enjeksiyonu (Karmaşık V inhibitörü) sonra, maksimal birleştiğinde solunum ya da State 3. Üçüncü paneli temsil nedeniyle solunum temsil proton sızıntısı, ya da Devlet 4o için. Dördüncü panel FCCP enjeksiyonundan sonra, maksimum Kuplajsız solunum veya Devlet 3U temsil eder. Son olarak, beşinci paneli Antimycin A enjeksiyonundan sonra, oksidatif solunumun engellenmesini gösterir. Özellikle, arkl mitokondriyal devletler minimal standart sapma var. Bu mitokondriyal stok ve mitokondri / substrat karışımları ve bağlılık dönüş (Adım 2.6) sonra mitokondri tek tek tabaka ulaşma kapsamlı karıştırma kaynaklanmaktadır. Öte yandan, her bir göze olup mikrolevhanın oyuk mitokondri tek tek tabaka elde eşit olmayan mitokondri yükleme Şekil 2 'de gösterildiği gibi, her bir durumda, standart sapma sebep olur. Her mitokondriyal devlet ve her alt tabaka için Şekil 1 ekran yaylalarda iz. İki ölçüm döngüsünden sonra elde plato iyi mitokondriyal kalitesini göstermektedir ve mitokondri tahlil süresince de uyulması kalması. Bu sayede oluşabilecek önyargı azaltarak, araştırmacı bu mitokondriyal devletlerin ortalama OCR almasına izin veriyor çünkü ek olarak, plato maksimal oranları ulaşılması daha arzu edilebilirkeyfi bir noktaya seçerek. Oyuk başına mitokondri miktarı optimizasyonu çalışmalarla belirlenmiştir. Oyuk başına mitokondri optimum miktar, State sonuçlanmalıdır 100-200 pmol / dak / oyuk ve devlet 3 oranları <2 ila oranları 1500 pmol / dak / oyuk, bu değerler, çok oyuklu oksijen dinamik oksijen algılama aralıkta olması nedeniyle tüketim ölçüm makinesi. Kuyu başına çok mitokondriyal protein yüklenmesi. Enstrüman (Şekil 3A) dinamik aralığın dışında OCRs neden (3 kuyu başına mitokondriyal protein yüklenmesi 2.5 ug göre kuyu başına mitokondriyal protein (mavi izleme) ve 3.5 ug yükleniyor tasvir kırmızı Şekil olabilir süksinat / rotenone tahlil için) izleme. Kuyu başına çok mitokondriyal protein yüklenmesi de böylece birbirini izleyen ölçümü 9 (Şekil 3B <OCR doğru ölçümü engelleyen, kuyunun microchamber içinde oksijenin tükenmesi yol açabilir/ strong>). Noktadan noktaya OCR OCR değişim anlık oranıdır. Düz ise, OCR / sabit kararlı olduğunu, ancak azalan, sonra bir biyolojik veya teknik bir sorun olabilir. Devlet 3 Devlet 3u solunum (Şekil 3A) OCR dik düşüş ölçümü (Şekil 3B) sonundan önce oksijen kaynağı yorucu mitokondri neden olur. Şekil 4, elektron akışı analizi için zamana karşı OCR temsil eder. Şekil 1 için tarif edildiği gibi izleme giderilmiştir ve görüntülenir. Bu deneyde ilk panel ikinci panel, rotenone enjeksiyonundan sonra, kompleks I aracılı solunum inhibisyonu Kompleks I ile piruvat / malat Devlet 3u solunum temsil eder. Üçüncü paneli, süksinat enjeksiyonundan sonra, elektronlar Kompleks II'nin (Site II aracılı solunum) de ETC girerek substrat uyarılan Devlet 3U temsil eder. Antim enjeksiyonundan sonra dördüncü panelgentamisin A, Kompleksi III ve böylece toplam solunum inhibisyonu temsil eder. Son olarak, beşinci paneli, askorbat / TMPD enjeksiyonundan sonra, Kompleks IV aracılı solunum temsil eder. Şekil 1'de traselerine benzer tüm mitokondriyal devletler minimal standart sapma var ve her oran bir plato ulaşmıştır neredeyse vardır ya. Şekil 1. Birleştirme Deneyleri (A). 10 mM piruvat / 5 mM malat, (B), 10 mM süksinat / 2 uM rotenon, (C) 40 uM palmitoil karnitin / 1 mM malat ve (D) 10 mM glutamat / 10 mM oksijen tüketimi, çok oyuklu ölçümü ile tespit edildiği üzere, malat mitokondriyal solunum deney trase bağlanmış. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. Kuyu başına yüklenen Mitokondriyal protein süksinat / rot dışındaki tüm analizleri için 3.5 ug oldumitokondriyal protein 2.5 ug göz başına kullanan enon. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 – (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Piruvat; SUCC = Süksinat; ROT = Rotenone; PAL-C palmitoil karnitin =; GLUT = glutamat. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2. Yüksek derecede Değişken Piruvat / Malat Deneyi. Eksik ve böylece değişken mitokondriyal pro yol alt tabaka / MAS karışımı mitokondriyal stoktan mitokondri karıştırma kaynaklanan yüksek değişken 10 mM piruvat / 5 mM malat tahlilHer oyuktaki tein yükleme. Oyuk başına yüklü Mitokondrial proteini 3,5 ug idi. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 – (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Piruvat. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Sukinat / Rotenone Testi için Şekil 3. Aşırı Mitokondriyal Protein. (A) kuyu başına mitokondriyal protein (mavi izleme) ve 3.5 ug yükleyerek neden çok iyi oksijen tüketimi ölçüm makinesinin dinamik aralığının dışında Oksijen tüketimi oranları kuyuda (kırmızı izleme) başına mitokondriyal protein yüklenmesi 2.5 ug göre. (B ) Oxyaklaşan gerginlik yGen sıfır ADP ve kuyu başına mitokondriyal protein optimal miktarda (2.5 ug) (kırmızı izleme) yüklenmesi ile karşılaştırıldığında iyi (mavi tracing) başına aşırı mitokondriyal protein (3.5 ug) yükleyerek neden FCCP enjeksiyonlar takip. Veriler mitokondriyal protein miktarı başına n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 – (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; SUCC = Süksinat; ROT = Rotenone; O 2 = oksijen; cıva mm Hg = milimetre. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4. Elektron Akış Testi. 5 mM piruvat / 1 mM malat + 4 iM FCCP, elektron foksijen tüketimi, çok oyuklu ölçülmesi ile belirlendiği üzere, düşük mitokondriyal solunum deneyi takip. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. Oyuk başına yüklü Mitokondrial proteini 3,5 ug idi. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; Anti-A = Antimycin A; Artan = Askorbat; TMPD = N, N, N ', N' tetrametilsiklopentadienil p -fenilendiamin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Ayıraç Hazır Konsantrasyon MW Nihai Cilt Kitle Eklendi Yorumlar / Açıklama (M) (g / mol) (mi) </strong> (g veya ml) EGTA, pH 7.2 0.1 380,35 1 M Tris baz, 100 mi 3,801 g Mağaza 4 ° C 'de HEPES 1 238,3 Dihidro 2 O 250 mi 59. 57 g Mağaza 4 ° C 'de MgCl2, heksahidrat 1 203,31 Dihidro 2 O 250 mi 50,82 gr Mağaza 4 ° C 'de Piruvat pH 7.4 0.1 88,06 (14,11 M solüsyon olarak gelir) Dihidro 2 O 40 mi Piruvik asit 0,283 mi -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler hazırlayın ve mağaza sağlayın her iki haftada bir taze yapmak Süksinat pH 7.4 0.5 118,09 Dihidro 2 O 100 mi Su 9.4 gccinic asit -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler hazırlayın ve mağaza sağlayın Malat, pH 7.4 0.5 134,09 % 95 Etanol 100 ml Malik asit 6.7 g -20 ° C'de 200 ul alikotları ve mağaza olun TMPD 0.01 164,25 10 mi 0,0164 g -20 ° C'de 300 ul alikotları ve mağaza olun; Indirgenmiş TMPD tutmak için askorbat bir eş-molar miktarıyla karıştırılır Palmitoil L-karnitin klorit 0.01 436,07 % 95 Etanol ve 1.14 mi 0.005 g -20 ° C'de 40 ul alikotları ve mağaza sağlayın Oligomycin A 0.006 791,06 % 95 Etanol 0.987 ml 0.005 g -20 ° C'de 20 ul alikotları ve mağaza sağlayın </tr> FCCP 0.01 254,17 % 95 Etanol ve 3,9 mi 0,01 g -20 ° C'de 40 ul alikotları ve mağaza sağlayın Rotenone 0.001 394,4 % 95 Etanol ve 10 ml 0.0039 g -20 ° C'de de Antimycin A 0.005 548,63 % 95 Etanol ve 9.12 mi 0.025 g -20 ° C'de de K + ADP 0.5 501,32 MHP 2 O 3.9 ml 1.0 g -20 ° C'de de Malik asit, pH 7.4 0.5 134,09 40 mi 2.68 g -20 ° C'de 200 ul alikotları ve mağaza olun <strong> Tablo 1. Stok Çözümleri Ayıraç Hazır Konsantrasyon Kitle Eklendi Final Molarite / Yüzde (M) (g veya ml) Sakaroz – 11,98 g 70 mM Mannitol – 20.04 gr 220 mM Potasyum fosfat monobazik – 0.34 g 5 mM MgCl2, heksahidrat 1 2,5 mi 5 mM HEPES 1 1,0 mi 2 mM EGTA 0.1 5,0 mi 1 mM Esas yağlı asit, SERBEST BSA – 1.0 g % 0.20 . Tablo 2. MAS Mix pH 7.4, 500 ml: Kısım 25 ml ve mağaza -20 ºC * Not at: tahlil enjeksiyonlar için kullanılan MAS karışımı için BSA hariç. Yüzey Orta Nihai Konsantrasyon Stokta miktarı (ul) MAS * Miktarı (ml) Piruvat / Malat 10 mM / 5 mM Piruvat: 1000 9 Malat: 100 Succicinate / Rotenone 10 mM / 2 mcM Süksinat: 200 10 Rotenone 20 * Piruvat / malat + FCCP 5 mM / 1 mM / 4 uM Piruvat: 500 10 FCCP: 4 Malat: 20 Palmitoil L-karnitin / Malat 40 uM / 1 mM Palmitoylcarnitine: 40 malat: 20 10 Glutamat / Malat 10 mM / 10 mM Glutamat: 400 10 Malat: 200 Tablo 3. Yüzey Çözümleri pH 7.4: Deney gün taze olun. * Elektron akış deneyi çözeltisi. Enjeksiyon Orta Konsantrasyon Stokta miktarı (ul) <td> MAS Miktarı (ml) Tutar Kartuş enjekte Nihai Konsantrasyon (İkinci levha enjekte) ADP 50 mM 300 ul 3 50 ul 5,0 mM Oligomycin A 20 uM 10 ul 3 55 ul 2,0 uM FCCP 40 uM 12 ul 3 60 ul 4,0 uM Antimycin A 40 uM 24 ul 3 65 ul 4,0 uM TCoupled Tahliller için mümkün 4. Enjeksiyonlar pH 7.4. Deney gün taze olun. * Birleştirme tahlilleri bulunmaktadır (bunlarla sınırlı değildir), piruvat / malat, süksinat / rotenon, palmitoil karnitin / malat ve glutamat / malat. Enjeksiyon Orta Konsantrasyon Stokta miktarı (g veya ul) MAS Miktarı (ml) Tutar Kartuş enjekte (İkinci levha enjekte) nihai konsantrasyon Rotenone 20 uM 60 ul 3 50 ul 2,0 uM Sukinat 50 mM 300 ul 3 55 ul 5,0 mM Antimycin A 40 uM 24 μl 3 60 ul 4,0 uM TMPD / Ascorabte 1 mM, 100 mM TMPD: 300 ul 3 65 ul 100 uM, 10 mM Askorbat: 0,059 g Elektron Akış Testi için Tablo 5. Enjeksiyonlar pH 7.4. Deney gün taze olun Komut Süre (dk) Döngü içinde Kalibre Bekleyin 10 dakika (plaka uyumu aşamasından ısınmasını sağlamak için) Karıştırmak 1 dakika 2 Beniaşure 2 dakika A enjekte Karıştırmak 1 dakika 2 Tedbir 2 dakika B enjekte Karıştırmak 1 dakika 2 Tedbir 2 dakika C enjekte Karıştırmak 1 dakika 2 Tedbir 2 dakika D enjekte Karıştırmak 1 dakika 2 Tedbir 2 dakika Tablo 6. Enstrüman çalıştırın Protokolü.