Cryosectioning Метод микродиссекции мышиной слизистой оболочки толстой кишки

Разделы толстой кишки ткани были обработаны для гистологического оценки и Н & Е окрашивания 13. Традиционный разрез слизистой оболочки видно на фиг.2А. Базальные области содержат наружный мышечный, состоит в основном из круговых мышечной. Исходя сторону просвета, мышечной слизистой очевидно, прилегающих к Crypt-база эпителиальных клеток, переходные клетки находятся в середине ткани, и, наконец, популяции клеточной поверхности сталкиваются просвета кишечника. Последовательный метод секционирования описано здесь сохраняет ориентацию таким образом, чтобы продольные и круговые мышечной встречаются первый (фиг.2В), а затем в мышечной слизистой (фиг.2с). Обратите внимание на внешний вид немышечных интерстициальных клеток в верхнем левом углу изображения. Для анализа на выходе описано ниже, участки мышц, отбрасываются. Последующие разделы содержат эпителиальные клетки и интерстициальной ткани (собственная пластинка), Начиная с склеп-базовых элементов (рис 2D). Обратите внимание на отсутствие центрального просвета в наиболее склепы, которые темнее из-за плотно упакованных ядер. Эти слои содержат пролиферативную отсек. Переходные клетки появляются, как плотно железы с выдающимися центральных люмен (рис 2E). Наконец, население клеточной поверхности имеют неправильную структуру, с участками эпителия монослоя смотреть анфас (рис 2F). Серийные срезы, как описанные выше, также могут быть обработаны для иммунофлуоресцентного маркировки и конфокальной микроскопии (как описано здесь, 14). Рисунок показывает 2G изолированные крипты фиксированные и проницаемыми в 100% метанола, а затем окрашивали в течение ядер (синий) и клетка-клетка соединительной белка блокатора малой зоны Occludens 1 (ZO-1, зеленый). В традиционной ориентации срезов, склеп и клеточной поверхности можно рассматривать одновременно (рис 2G </stronг>). Обратите внимание, что в ЗО-1 узловой пятно линий просвет толстой склепе. Это Z0-1 прокладка просвет можно также рассматривать в последовательных секционных образцов переходных клеточных популяций, в центре круглого желез (рис 2G). Расширенные ZO-1 пятно видно в популяциях поверхность клеток (рис 2I и J). Несколько факторов дифференциации, как известно, выражается в пространственно-временной моды вдоль оси крипта-поверхность. Это включает транскрипционный фактор Kruppel-подобный фактор 4 (Klf4), который, как известно, обогащенный популяций клеточной поверхности. При использовании традиционных способов секционирования, KLF4 находится в ядрах просвет, стоящих население поверхности клетки (рис 2K). Поэтому мы предположили, что KLF4 мРНК будет преимущественно экспрессируется в популяциях поверхности клеток. Чтобы проверить это, серийные срезы были собраны и сгруппированы в поверхностные, в переходный период, и склеп-базовых образцов. Subsequently, РНК собирали при помощи стандартного извлечение тризола, с дополнительным Очистка колоночной RNeasy и лечения ДНКазы. РНК была получена из 5 объединенных последовательных секций, которые дали между 5-10 мкг общей РНК в образце. Эти образцы были затем подвергнуты полуколичественный ПЦР в реальном времени и для KLF4 и контрольного гена, ТАТА-блок связывающего белка 1 (ТБФ-1) (рис 2 л) 14. Как показано на рисунке 2 л, после нормализации до ТБФ-1, на поверхности клетки экспрессируют вплоть до 8 раз KLF4 мРНК, что выражается в клеток крипт. Аналогичным образом, уровень белка KLF4 было обнаружено обладают пространственной регулирование вдоль оси крипты поверхности. Серийные срезы были объединены, как описано выше, а затем инкубировали в буфере для лизиса в течение 20 мин при 4 ° С. Это давало между 200-250 мкг белка в образце. Затем образцы подвергали анализу с помощью SDS-PAGE (рис 2М) 15. Как показано на рисунке 2М, KLF4 рУровни rotein являются значительно выше в популяциях клеточной поверхности. Вышеуказанные результаты показывают способность этого протокола, чтобы изолировать большое количество поверхности и эпителиальных клеток крипт из мышиного слизистой оболочки толстой кишки. Рисунок 1: () Схематическое изображение мышиный слизистой оболочки толстой кишки и внешние слои мышц. Наш метод направлен на сбор отдельные группы клеточной поверхности и склеп-базовые сотовые последовательным cryosectioning (10 мкм каждый). Внешние слои мышц, отбрасываются. Высота (В) Crypt изменяется вдоль длины ободочной кишки (расстояние между крипт-базовых и поверхностных слоев). Точки данных указывают отдельные измерения склеп и символы указывают на биологические повторов (N = 4). (C) сегментов толстой кишки собирают, пополам, и удержал на кремниевую рассекает блюдо. (D) тканей себеgment примерно 3 см от заднего прохода нажата между ними, чтобы бритвенных лезвий и замораживали на сухом льду. (Е) ткани затем монтируется на предварительно выровнена блока Октябрь. (F) криосрезах удаляют и визуально. Рисунок 2:. Представительные данные () толстой ткани окрашивали гематоксилин-эозином в поперечном сечении, показывающий циклические мышечной (см), мышечной слизистой (мм), крипты-Базовые элементы, переходные клетки, и поверхностные клетки. (В – С) толстой слои мышц. (D) Склеп-базовые клетки. Обратите внимание на отсутствие центрального просвета. (Е) Переходные клетки. (F) поверхности клетки. (G), иммунофлуоресценции окрашивание изолированных кишечных крипт. ZO-1 (зеленый) и ядра (синий) наблюдаются в поперечном сечении. (HI) ZO-1 и ядерного окрашивание в переходных и поверхностных клеток. (J), увеличенный вид ZO-1 окрашивания. (К) KLF4 (зеленый) обогащен населения клеточной поверхности. (L), ПЦР в реальном времени оценка уровня мРНК KLF4 между тремя отделениями. (М) Вестерн-блот-анализ уровней белка Klf4 в этих клеточных популяций.