Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut
Summary
Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.
Abstract
The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.
Introduction
Die Colon-Epithel ist ein hoch regenerativer Gewebe, mit Wohnsitz Stammzellen Auffüllen der Gewebe alle paar Tage ein. Dieser Prozess der Regeneration erfordert die Aufrechterhaltung einer proliferativen Stammzellkompartiments. Im Laufe der Zeit können die neu erzeugten Tochterzellen verlieren ihre proliferative Potenzial und wandern zu der luminalen Oberfläche des Darms. Gleichzeitig mit der Migration zu unterscheiden Vorläuferzellen in reife Barriere bildenden Enterozyten oder Schleimhaut produzierenden Becherzellen. Ausfall dieses Differenzierungsprogramms wird angenommen, tragen zur Epithelbarriere beeinträchtigt, wie es in entzündliche Darmerkrankungen und Kolonkrebs 2,3 beobachtet.
Studieren der obigen Prozesse werden Methoden zur Isolierung von Krypta-Basis- und Oberflächenzellpopulationen erforderlich. Mehrere Methoden existieren, die jeweils mit einzigartigen Vorteilen und Nachteilen. Aktuelle Verfahren für die Isolierung von intestinalen Epithelzellen schließen CHelating Mittel sowie mechanische Dissoziation, was in der Isolierung des gesamten Krypten Epithellappen oder Einzelzellen, abhängig von den experimentellen Bedingungen 4,5. Dies sind Hochzinsmethoden, noch Änderungen der interzellulären Signalübertragung haben unter diesen Bedingungen, die nicht der nativen Umgebung 6,7 darstellen können gemeldet. Laser Mikrodissektion ermöglicht die Sammlung von Raum unterschiedlichen Material, sondern erreicht mit niedrigem Molekular Ausbeute 8,9. In menschlichen Dickdarmgewebe, haben Serien horizontal Kryoschneiden Methoden entwickelt worden 10. Allerdings sind murine Schleimhautgewebe unerschwinglich klein für die direkte Verwendung dieser Technik. Beim Menschen Darm Krypta Längen (die ferne zwischen der Krypta-Basis und Oberflächenzellen) in den Dickdarm liegt zwischen ~ 100-1000 & mgr; m 11. Bei Mäusen sind crypt Längen zwischen ~ 50-300 & mgr; m (siehe Abbildung 1A). Die geringe Größe der murine Krypten stellt eine Herausforderung für die isolation dieser beiden Zellpopulationen in einem der vorhandenen Protokolle.
Wir beschreiben nun eine kostengünstige, High-Yield-Verfahren zur Isolierung von Krypta-Basis und Oberfläche epithelialen Zellpopulation in murinen Dickdarmgewebe. Gewebe in dieser Weise geerntet kann dann durch eine Reihe von Standard-Downstream-Anwendungen, einschließlich Immunfluoreszenzfärbung, RT-PCR (Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion) oder Western-Blot analysiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die molekularen Mechanismen in Kolonepithelzellen Zellproliferation und -differenzierung beteiligt sind kaum verstanden. Dies schließt Lücken in unserem Verständnis der zellulären Signalumgebung des Stammzellkompartiments an der Basis der Krypten Kolonepithel. Es besteht auch ein zunehmendes Interesse an der Prozesse, die Enterozyten Differenzierung unterliegen. Zum Beispiel, ein besseres Verständnis der in vivo Differenzierung wird als Benchmark für Studien an der Herstellung von in vitro Primärdarmsysteme 16 ausgerichtet erforderlich.
Das obige Verfahren beinhaltet mehrere Schritte, die besondere Maßnahmen erfordern. Erstens, das Entfernen der Ränder um die gefrorenen Gewebesegment (wie in Abschnitt 3.2 diskutiert) als die Geweberänder beim Präparieren und Einfrieren curl erforderlich. Die Nichtbeachtung dieser Kanten Ergebnisse zu bewegen ist eine Mischpopulation von Oberfläche und Krypta Basiszellen. Montage des Gewebes auf einem vorgekühlten, eingeebnet Oktober Block ist auch wichtig. Tseinem Protokoll kann zu anderen Bereichen des distalen Kolons durch Verändern der Anzahl von Abschnitten in jedem Pool angepasst werden. Zum Beispiel, wie in 1B gezeigt, variiert Mukosakryptenbereichs Länge zwischen 150-300 um. Daher wird, wenn die Untersuchung der Bereich zwischen 4 cm 6 cm vom Anus aus, die Anzahl der Abschnitte ist von 15 bis 30. Es ist wichtig erhöht werden, wird dieses Protokoll nicht für das proximale Colon vorgeschlagen (7 cm-9 cm) durch Falten ( plicae obliquae), die in das Lumen zu verlängern macht es unmöglich, getrennte Oberfläche und Krypta-Basiszellen durch Serienschnitt.
Serienschnitt Techniken wurden verwendet, um Krypta-Basis zu studieren und Oberfläche epithelialen Zellpopulationen in den Menschen. Fügt jedoch unser Protokoll zusätzliche Schritte, die aufgrund der geringen Größe des Maus-Gewebe erforderlich sind. Wir schlagen vor, dass das obige Protokoll wird für die Untersuchung der Krypta-Basis und Oberfläche epithelialen Zellpopulation in genetisch tractable Maus-Systeme ermöglichen. Tatsächlich vereinigt Abschnitte Yield hochwertiges Protein und RNA geeigneten nachgeschalteten Analyse. Zukünftige Anwendungen könnte die Untersuchung von Zellsignalwege oder Chromatinimmunpräzipitation enthalten. Es sollte jedoch beachtet werden, dass, wie einige der vorstehend beschriebenen alternativen Verfahren, enthalten die resultierenden Abschnitte eine Mischung von epithelialen und interstitielle Lamina propria Zellen sein. Im Ergebnis ist die hier beschriebene Protokoll stellt eine schnelle, hohe Ausbeute Methode für die Analyse von molekularen Prozessen in räumlich unterschiedlichen Regionen des murinen Colon-Schleimhaut.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn’s and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.
Materials
| Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
| MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
| LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| Materials | |||
| OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
| cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
| High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
| GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
| Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
| 27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
| TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Rneasy | Qiagen | 74104 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | |
| Reagents | |||
| Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
| Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
| Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
| Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
| Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
| Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
| HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
| RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
| PCR Primers | |||
| primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
| primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
| primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
| primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).
- Humphries, A., Wright, N. A. Colonic crypt organization and tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).
- Weber, C. R., Turner, J. R. Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall. Gut. 56, 6-8 (2007).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Rand, M. D., et al. Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors. Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).
- Lechner, S., et al. Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia. Gut. 52, 1148-1153 (2003).
- Reizel, Y., et al. Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction. PLoS Genet. 7, e1002192 (2011).
- Kosinski, C., et al. Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).
- Tamura, S., et al. Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm. J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine. Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040 (2012).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
- Neumann, P. A., et al. Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon. Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).
- Capaldo, C. T., et al. Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins. Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).
- Wells, J. M., Spence, J. R. How to make an intestine. Development. 141, 752-760 (2014).
