Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

Seções de tecido do cólon foram processados ​​para avaliação histológica e H & E coloração 13. Uma vista em secção transversal tradicional da mucosa é visto na Figura 2A. Áreas basais conter o muscular externa, composta principalmente dos muscularis circulares. Prosseguindo para o lúmen, a mucosa muscularis é evidente adjacente para as células epiteliais de cripta-base, as células são transitórias no meio do tecido, e finalmente, as populações de células de superfície da face do lúmen do intestino. O método descrito aqui cortes seriados mantém uma orientação tal que os muscularis longitudinais e circulares são encontrados primeira (Figura 2B), seguido pela mucosa muscular (Figura 2C). Observe a aparência das células intersticiais não-musculares no canto superior esquerdo da imagem. Para a análise a jusante descrito abaixo, as secções de músculo são descartados. As seções posteriores contêm células epiteliais e tecido intersticial (lâmina própria), Começando com as células de cripta-base (Figura 2D). Note-se a ausência de um lúmen central, na maioria das criptas, que aparecem mais escuras devido aos núcleos estreitamente empacotadas. Estas camadas contêm o compartimento proliferativa. As células de transição aparecem como bem embalado glândulas com lumens centrais proeminentes (Figura 2E). Por último, as populações de células da superfície tem uma estrutura irregular, com áreas de monocamada epitelial viram en face (Figura 2F). Cortes seriados como descritos acima podem também ser tratados para a rotulagem de imunofluorescência e microscopia confocal (como descrito aqui 14). Figura 2G mostra criptas isoladas fixas e permeabilizadas em 100% de metanol e, posteriormente coradas para núcleos (azul) e da proteína de junção célula-célula zonula occludens 1 (ZO-1, verde). Na orientação de corte tradicional, células da cripta e da superfície pode ser visto simultaneamente (Figura 2G </strong>). Note-se que as linhas de junção mancha ZO-1 do lúmen da cripta do cólon. Esse revestimento Z0-1 do lúmen também pode ser visto em amostras seccionadas em série de populações de células de transição, no centro das glândulas circulares (Figura 2G). Aprimorado ZO-1 mancha é visto em populações de células de superfície (Figura 2I e J). Vários factores de diferenciação são conhecidos a ser expresso de uma forma espaço-temporal ao longo do eixo cripta-a-superfície. Isto inclui o factor de transcrição-Kruppel como factor de 4 (KLF4), que é conhecido por ser enriquecido em populações de células de superfície. Usando métodos tradicionais de seccionamento, KLF4 é encontrada nos núcleos de lúmen populações de células de superfície (Figura 2K) enfrentando. Nós portanto especulado que KLF4 ARNm poderia ser predominantemente expresso em populações de células de superfície. Para testar isso, cortes seriados foram coletadas e agrupadas em amostras de superfície, de transição, de criptas e-base. Subsequently, o ARN foi colhido utilizando Trizol extracção padrão, com uma purificação adicional por coluna RNeasy e tratamento com DNAse. RNA foi coletado de cinco secções consecutivas em pool, que renderam entre 5-10 mg de RNA total por amostra. Estas amostras foram então submetidas a tempo de semi-quantitativo PCR real tanto para KLF4 e um gene de referência, a ligação da proteína caixa TATÁ 1 (TBP-1) (Figura 2L) 14. Como mostrado na Figura 2L, após normalização para a TBP-1, células de superfície foram encontrados para expressar até 8 vezes o ARNm KLF4 que é expresso em células da cripta. Do mesmo modo, os níveis de proteína KLF4 foram encontrados para expor regulação espacial ao longo do eixo cripta-superfície. As secções em série foram recolhidas como descrito acima e, em seguida, incubadas em tampão de lise durante 20 min a 4 ° C. Isto produziu entre 200-250 mg de proteína por amostra. As amostras foram então sujeitas a análise por SDS-PAGE (Figura 2M) 15. Como mostrado na Figura 2 M, p KLF4níveis rotein são dramaticamente mais elevada em populações de células de superfície. Os resultados acima demonstram a capacidade deste protocolo para isolar grandes quantidades de células epiteliais superficiais e das criptas da mucosa do cólon murino. Figura 1: (A) mostrando esquemática da mucosa do cólon de murino e as camadas musculares externos. Nosso método tem como objectivo recolher populações de células discretas de células superficiais e cripta-base por cryosectioning serial (10 m cada). As camadas musculares externos são descartados. Altura (B) Crypt varia ao longo do comprimento do cólon (a distância entre as camadas de base e de cripta-superficiais). Os pontos de dados individuais indicam as medições das criptas e símbolos indicam réplicas biológicas (n = 4). (C) segmentos de cólon recolhido, dividido, e preso em um silício dissecar prato. (D) Um tecido segment aproximadamente 3 cm do ânus é prensada entre a lâminas de barbear e os congelados em gelo seco. (E) O tecido é, em seguida, montado sobre um pré-nivelado bloco PTU. (F) Cortes congelados são removidos e inspeccionados visualmente. Figura 2:. Os dados representativos (A) de tecido do cólon corado com Hematoxilina-Eosina, em corte transversal, que mostra a muscular circular (em cm), a mucosa muscularis (mm), as células de cripta-base, células de transição, e de células de superfície. (B – C) camadas musculares do cólon. (D) As células da cripta de base. Note-se a ausência de um lúmen central. (E) células transitórias. (F), as células de superfície. (G) Imunofluorescência coloração das criptas colônicas isoladas. ZO-1 (verde) e núcleos (azul) são observadas em corte transversal. (HI) ZO-1 e coloração nuclear em células de transição e de superfície. (J) visão ampliada de ZO-1 coloração. (K) KLF4 (verde) está enriquecido nas populações de células de superfície. (G) em tempo real os níveis de avaliação de PCR de ARNm KLF4 entre os três compartimentos. (M) análise de Western blot de KLF4 níveis de proteína nestas populações de células.