Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית
Summary
Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.
Abstract
The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.
Introduction
בטנת אפיתל במעי הגס היא רקמת משובי מאוד, עם תאי גזע תושב חידוש הרקמות כל כמה ימים 1. תהליך זה של התחדשות דורש התחזוקה של תא בתאי גזע שגשוג. במשך זמן, תאי בת פיק החדש יאבדו פוטנציאל השגשוג ונודדים לעבר פני השטח luminal של המעי. ביחד עם הגירה, ותאים להתמיין enterocytes יוצרי מחסום בוגר או תאי גביע ייצור ריר. כישלון של תכנית בידול זה חשב לתרום להתפשר מחסום האפיתל כגון נצפה במחלת מעי דלקתית וסרטן מעי גס 2,3.
מחקר מפורט של התהליכים לעיל דורש מתודולוגיות לבידוד אוכלוסיות קריפטה-בסיס ותאי שטח. מספר שיטות קיימות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות ייחודיים. שיטות קיימים לבידוד של תאי אפיתל במעי כוללות פרקסוכנים, מרומם רוח וניתוק מכאני, וכתוצאה מכך הבידוד של מאורות כל, גיליונות אפיתל, או תאים בודדים, תלויים ב4,5 תנאי ניסוי. אלה הם שיטות תשואה גבוהות, אך שינויים באיתות אינטר כבר דיווחו בתנאים אלה שלא יכולים לייצג את הסביבה המקומית 6,7. microdissection ללכוד לייזר מאפשר לאיסוף חומר שונה במרחב, אבל משיג תשואת 8,9 מולקולרי נמוכה. ברקמת מעי הגס אנושית, שיטות cryosectioning אופקיים סידוריים פותחו 10. עם זאת, רקמות הריריות עכברית הן להחריד קטנות לניכוס ישיר של טכניקה זו. בבני אדם, באורכי קריפטה מעיים (הרחוקים בין הכוך-הבסיס ותאי שטח) במעי הגס נע בין 100-1,000 ~ מיקרומטר 11. בעכברים, אורכי קריפטה הם בין 50-300 ~ מיקרומטר (ראו איור 1 א). הגודל הקטן של מאורות עכברי מציב אתגר לIsolation של שתי אוכלוסיות תאים אלה תוך שימוש בפרוטוקולים קיימים.
עכשיו אנו מתארים בעלות נמוכה, שיטת תשואה גבוהה לבידוד של קריפטה-בסיס ומשטח אוכלוסיית תאי אפיתל במעי הגס רקמה עכברית. רקמה שנקטפו באופן זה עשויה אז להיות מנותח על ידי מספר היישומים במורד הזרם סטנדרטיים, כוללים מכתים immunofluorescence, RT-PCR (תגובת שרשרת זמן-פולימראז ריאל) או מערבי סופג.
Protocol
Representative Results
Discussion
המנגנונים המולקולריים המעורבים בהפצה הגס אפיתל תאים והתמיינות הם הבינו היטב. זה כולל פערים בהבנה של סביבת האיתות התאית של התא בתאי גזע בבסיס מאורות אפיתל במעי הגס שלנו. יש גם עניין גובר בתהליכים שבבסיס בידול האנתרוציט. לדוגמא, עלה הבנה של הבידול בvivo נדרשת כאמת מידה למחקרים שמטרתם לייצר במבחנה מערכות מעיים עיקריות 16.
ההליך שלעיל כולל מספר צעדים שדורשים תשומת לב נוספת. ראשית, הסרת הקצוות סביב קטע הרקמה הקפוא (כאמור בסעיף 3.2) נדרש כקצות רקמת התלתל במהלך נתיחה והקפאה. כישלון להעביר תוצאות קצוות אלה הוא אוכלוסייה מעורבת של תאי שטח ובסיס קריפטה. ההרכבה הרקמה באוקטובר לחסום מראש צונן, מפולס היא גם חיונית. Tהפרוטוקול שלו יכול להיות מותאם לאזורים אחרים של מעי גס דיסטלי על ידי שינוי מספר הסעיפים בכל בריכה. לדוגמא, כפי שמוצג באיור 1, אורך קריפטה רירית משתנה בין 150-300 מיקרומטר. לכן, כאשר לומדים את האזור שבין 4 ס"מ 6 סנטימטר מפי הטבעת, מספר סעיפים צריך להיות מוגבר בין 15 ל 30. חשוב לציין, פרוטוקול זה לא מומלץ למעי הגס הפרוקסימלי (7 ס"מ 9 סנטימטרים) בשל קפלים ( plicae obliquae) המשתרעת לתוך הלום שהופך אותו בלתי אפשרי לתאי שטח וקריפטה-בסיס נפרדים על ידי חתך סדרתי.
טכניקות חתך סידוריים שימשו ללמוד קריפטה-בסיס ומשטח אוכלוסיות תאי אפיתל בבני אדם. עם זאת, הפרוטוקול שלנו מוסיף צעדים נוספים הנדרשים בשל גודלו הקטן של רקמה עכברית. אנו מציעים כי בפרוטוקול לעיל יאפשר לחקירת קריפטה-בסיס ואוכלוסיית תאי אפיתל פני השטח במערכות עכבר גנטי צייתנית. ואכן, חלקים נקוו yieחלבון LD באיכות גבוהה וניתוח במורד הזרם המתאים RNA. יישומים עתידיים יכולים לכלול המחקר של מסלולי איתות תא או immunoprecipitation הכרומטין. עם זאת, יש לציין כי, כמו כמה מהשיטות חלופיות שתוארו לעיל, וכתוצאה מכך החלקים מכילים תערובת של תאי אפיתל propria lamina וביניים. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה מהירה, תשואה גבוהה לניתוח תהליכים מולקולריים באזורים במרחב המובהקים של רירית המעי עכברית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn’s and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.
Materials
| Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
| MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
| LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| Materials | |||
| OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
| cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
| High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
| GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
| Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
| 27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
| TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Rneasy | Qiagen | 74104 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | |
| Reagents | |||
| Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
| Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
| Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
| Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
| Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
| Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
| HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
| RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
| PCR Primers | |||
| primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
| primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
| primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
| primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).
- Humphries, A., Wright, N. A. Colonic crypt organization and tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).
- Weber, C. R., Turner, J. R. Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall. Gut. 56, 6-8 (2007).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Rand, M. D., et al. Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors. Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).
- Lechner, S., et al. Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia. Gut. 52, 1148-1153 (2003).
- Reizel, Y., et al. Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction. PLoS Genet. 7, e1002192 (2011).
- Kosinski, C., et al. Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).
- Tamura, S., et al. Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm. J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine. Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040 (2012).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
- Neumann, P. A., et al. Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon. Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).
- Capaldo, C. T., et al. Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins. Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).
- Wells, J. M., Spence, J. R. How to make an intestine. Development. 141, 752-760 (2014).
