マウス結腸粘膜の顕微解剖のための凍結切片法

結腸組織切片を組織学的評価およびH＆E染色のために処理した13。粘膜の伝統的な断面図を図2Aに見られます。基礎分野は、主に円形の筋層から成る外筋層が含まれています。内腔に向かって進むと、粘膜筋板は、陰窩 – ベースの上皮細胞に隣接して明らかである、移行細胞は、組織の真ん中にあり、最終的に、表面細胞集団は、腸管内腔に面し。ここで説明した連続切片法は粘膜筋板（ 図2C）、続いて縦方向および円形の筋層が最初に遭遇するような姿勢（ 図2B）を 、保持しています。画像の左上にある非筋間質細胞の出現に注意してください。以下に説明する下流の分析のため、筋切片は廃棄されます。以降のセクションでは、上皮細胞と間質組織（固有層を含んでいます）、陰窩ベース細胞（ 図2D）で始まります。による密に充填された核に暗く見える陰窩のほとんどにおいて中央管腔が存在しないことに注意してください。これらの層は、増殖コンパートメントが含まれています。移行細胞は顕著な中央ルーメン（ 図2E）と密に詰まった腺として表示されます。最後に、表面の細胞集団は、 顔 （ 図2F）JP見上皮単層の領域と、不規則な構造を有しています。 （ここでは14のように）上記のように連続切片はまた、免疫蛍光標識および共焦点顕微鏡法のために処理することができる。 図2Gは 、核（青）および細胞-細胞接合タンパク質閉鎖帯について染色し、続いて固定し、100％メタノールで透過処理し、単離された陰窩を示しOccludens 1（ZO-1、緑）。伝統的な切片の向きでは、cryptと表面の細胞を同時に表示することができます（ 図2G </stronG>）。結腸陰窩の内腔ZO-1接合部の汚れラインことに注意してください。管腔のこのZ0-1裏地も円形腺（ 図2G）の中央に、移行細胞集団の連続切片試料に見られます。拡張ZO-1染色は表面細胞集団（ 図2IおよびJ）に見られます。 いくつかの分化因子は、陰窩ツー面軸に沿って時空間的様式で発現されることが知られています。これは、表面の細胞集団が富化されることが知られている転写因子クルッペル様因子4（KLF4）を含みます。従来の切片法を用いて、KLF4、表面細胞集団（ 図2K）に対向管腔の核内に見出されます。そこで、KLF4 mRNAは主に表面細胞集団内で発現されるであろうと推測しました。これをテストするには、連続切片を採取し、表面、移行、および陰窩ベースサンプルに分類しました。 Subsequently、RNAは、RNeasyカラムとDNase処理により、さらに精製して、標準のTrizol抽出を用いて回収しました。 RNAは、サンプル当たりの総RNAの5-10μgの間に得られたプールされた5個の連続切片から回収しました。これらのサンプルは、その後、KLF4および参照遺伝子、TATAボックス結合タンパク質1（TBP-1）（ 図2L）14の両方に、半定量的リアルタイムPCRを行いました。 図2Lに示すように、TBP-1に正規化した後に、表面細胞は陰窩細胞中で発現される8回KLF4 mRNAにまで発現することが見出されました。同様に、KLF4タンパク質レベルは、陰窩面軸に沿って空間的調節を示すことが見出されました。上述した後、4℃で20分間、溶解緩衝液中でインキュベートしたように連続切片をプールしました。これは、サンプルあたりのタンパク質の200〜250μgの間に生じました。次に、試料をSDS-PAGE（ 図2M）15による分析を行いました。 図2Mに示すように、KLF4のProteinレベルは劇的に表面細胞集団において高いです。上記の知見は、マウス結腸粘膜から表面及び陰窩の上皮細胞を大量に単離するためのこのプロトコルの能力を実証します。 図1：マウス結腸粘膜および外部筋肉層を示す（A）の回路図。我々の方法は、シリアル凍結切片（10μmの各）により離散表面細胞および陰窩ベースの細胞集団を収集することを目的とします。外部筋肉層は破棄されます。 （B）墓所の高さは、コロン（陰窩ベースと表面層との間の距離）の長さに沿って変化します。データポイントは、個々の陰窩測定および記号は生物学的複製を示す指示（N = 4）。 （C）結腸セグメントは、収集二分、およびシリコン解剖皿に固定します。 SE（D）組織肛門からgment約3cmはカミソリの刃の間でプレスし、ドライアイスで凍結されています。 （E）組織は、その後、平坦化前のOCTブロックに取り付けられています。 （F）凍結切片を取り出し、目視で検査します。 図2：代表的なデータの円形筋（CM）を示す断面図でヘマトキシリン-エオシンで染色した（A）結腸組織、粘膜筋板（mm）で、陰窩-基本セル、移行細胞、および表面の細胞。 （B – C）結腸筋層。 （D）クリプト系細胞。中央管腔が存在しないことに注意してください。 （E）移行細胞。 （F）表面細胞。単離された結腸陰窩の（G）免疫蛍光染色。 ZO-1（緑）および核（青）は、断面で観察されます。 （HI）ZO-1と移行し、表面の細胞で核染色。 （J）ZO-1染色の拡大図。 （K）、KLF4（緑）は、表面の細胞集団において濃縮されます。 （L）3つの区画の間にKLF4 mRNAレベルのリアルタイムPCR評価。 （M）は、これらの細胞集団におけるKLF4タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。