Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.
The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.
بطانة القولون الظهارية هي الأنسجة التجدد للغاية، مع الخلايا الجذعية المقيمة تجديد الأنسجة كل بضعة أيام 1. هذه عملية تجديد تتطلب الحفاظ على التكاثري مقصورة الخلايا الجذعية. مع مرور الوقت، فإن الخلايا ابنة المنتجة حديثا تفقد إمكانية التكاثري، وتهاجر نحو السطح اللمعية من الأمعاء. تتزامن مع الهجرة، الخلايا الاصلية تفرق في المعوية لتشكيل حاجز ناضجة أو الخلايا المنتجة للكأس المخاطية. ويعتقد أن فشل هذا البرنامج التمايز للمساهمة في خطر حاجز الظهارية مثل ما لوحظ في مرض التهاب الأمعاء وسرطان القولون 2،3.
سوف دراسة مفصلة عن العمليات المذكورة أعلاه تتطلب منهجيات لعزل سرداب قاعدة والخلايا السطحية السكان. توجد أساليب متعددة، ولكل منها مزايا وعيوب فريدة من نوعها. الأساليب الحالية لعزل الخلايا الظهارية في الأمعاء تشمل الفصلوكلاء الإنتشاء والبراءة الميكانيكية، مما أدى إلى عزل الخبايا بأكملها، ورقة الظهارية، أو خلايا واحدة، تعتمد على الظروف التجريبية 4،5. هذه هي أساليب عالية الغلة، ولكن تم الإبلاغ عن التغييرات في إشارة بين الخلايا في ظل هذه الظروف التي قد لا تمثل البيئة المحلية 6،7. القبض على الليزر تسليخ مجهري يسمح لجمع المواد المكانية متميزة، ولكن يحقق الجزيئي المنخفض 8،9 الغلة. في أنسجة القولون الإنسان، مسلسل الطرق cryosectioning الأفقية وقد وضعت 10. ومع ذلك، والأنسجة المخاطية الفئران صغيرة باهظة للاعتماد المباشر لهذه التقنية. في البشر، وأطوال سرداب الأمعاء (والبعيدة بين سرداب قاعدة والخلايا السطحية) في القولون تتفاوت بين ~ 100-1،000 ميكرون 11. في الفئران، وأطوال سرداب ما بين 50-300 ميكرون ~ (انظر الشكل 1A). صغر حجم الخبايا الفئران تحديا لايزولانشوئها من هؤلاء السكان اثنين من خلية باستخدام بروتوكولات القائمة.
نحن الآن وصف منخفضة التكلفة، وطريقة العائد المرتفع لعزل سرداب قاعدة وسطح السكان الخلايا الظهارية في أنسجة القولون الفئران. الأنسجة التي تحصد في هذه الطريقة قد ثم يتم تحليلها من قبل عدد من التطبيقات المصب القياسية، بما في ذلك تلطيخ المناعي، RT-PCR (في الوقت الحقيقي، البلمرة المتسلسل) أو النشاف الغربي.
غير مفهومة الآليات الجزيئية المشاركة في القولون تكاثر الخلايا الظهارية والتمايز. وهذا يشمل فجوات في فهمنا للبيئة الإشارات الخلوية من مقصورة الخلايا الجذعية في قاعدة الخبايا الظهارية القولون. وهناك أيضا اهتمام متزايد في العمليات التي تكمن وراء خلية معوية التمايز. على سبيل المثال، زيادة مطلوب فهم في الجسم الحي التمايز كمقياس للدراسات تهدف الى انتاج في المختبر أنظمة المعوية الابتدائية 16.
يحتوي الإجراء أعلاه العديد من الخطوات التي تتطلب المزيد من الاهتمام. أولا، وإزالة الحواف حول قطاع الأنسجة المجمدة (كما هو مبين في القسم 3.2) مطلوب كما حواف الأنسجة حليقة أثناء تشريح والتجمد. الفشل في نقل هذه النتائج حواف هو يسكنها خليط من الخلايا السطحية وقاعدة سرداب. تركيب الأنسجة على قبل المبردة، أكتوبر كتلة تعادل الضروري أيضا. تيبروتوكول له يمكن أن تتكيف مع مناطق أخرى من القولون البعيدة عن طريق تغيير عدد من المقاطع في كل تجمع. على سبيل المثال، كما هو مبين في الشكل 1B، المخاطية طول سرداب يتراوح بين 150-300 ميكرون. لذا، عند دراسة المنطقة الواقعة بين 4 سم 6 سم من فتحة الشرج، ينبغي زيادة عدد الفروع من 15 إلى 30. الأهم من ذلك، لا اقترح هذا البروتوكول لالقولون الداني (7 سم 9 سم) وذلك بسبب طيات ( الثنيات المائلة) التي تمتد إلى التجويف مما يجعل من المستحيل خلايا منفصلة السطحية وسرداب قاعدة من قبل باجتزاء المسلسل.
وقد استخدمت تقنيات باجتزاء مسلسل لدراسة سرداب قاعدة وسطح السكان الخلايا الظهارية في البشر. ومع ذلك، لدينا بروتوكول يضيف خطوات إضافية مطلوبة نظرا لصغر حجم أنسجة الفئران. نقترح أن البروتوكول المذكور أعلاه سيسمح للتحقيق في سرداب قاعدة والسكان الخلايا الظهارية السطحية في أنظمة الماوس لين العريكة وراثيا. في الواقع، yie أقسام المجمعةدينار بروتين عالي الجودة وRNA تحليل المصب مناسبة. ويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية دراسة مسارات الإشارات الخلوية أو لونين مناعي. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه، مثل العديد من الطرق البديلة المذكورة أعلاه، تحتوي على أقسام أدى مزيج من الخلايا الظهارية الصفيحة المخصوصة والخلالي. في الختام، بروتوكول الموصوفة هنا يوفر، طريقة العائد المرتفع السريع لتحليل العمليات الجزيئية في مناطق مختلفة مكانيا من الغشاء المخاطي للقولون الفئران.
The authors have nothing to disclose.
Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn’s and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.
Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
Materials | |||
OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
Rneasy | Qiagen | 74104 | |
DNAse | Qiagen | 79254 | |
Reagents | |||
Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
PCR Primers | |||
primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |