This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15–1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.
Una ventaja importante de dispositivos de microfluidos es la capacidad de manipular pequeños volúmenes de muestra, reduciendo así los residuos de reactivos y la preservación de la muestra precioso. Sin embargo, para lograr la manipulación de la muestra robusto es necesario para hacer frente a la integración de dispositivos con el medio ambiente macroescala. Para llevar a cabo la separación de partículas repetible, sensible con los dispositivos de microfluidos, este protocolo presenta una plataforma de microfluidos automatizada e integrada completa que permite el procesamiento preciso de 0.15-1.5 ml muestras utilizando dispositivos de microfluidos. Los aspectos importantes de este sistema incluyen el diseño modular del dispositivo y los accesorios sólidos resultantes en el mundo fiable y flexible a chip conexiones, y manejo de fluidos totalmente automatizado que lleva a cabo la recogida de muestras de bucle cerrado, la limpieza del sistema de cebado y medidas para asegurar un funcionamiento repetible. Diferentes dispositivos de microfluidos pueden ser utilizados de forma intercambiable con esta arquitectura. Aquí incorporamos un dispositivo acoustofluidic, detalle su characterización, la optimización del rendimiento y demostrar su uso para el tamaño de la separación de las muestras biológicas. Mediante el uso de información en tiempo real durante los experimentos de separación, recogida de muestras está optimizado para conservar y concentrar la muestra. Aunque que requiere la integración de múltiples piezas de equipo, las ventajas de esta arquitectura incluyen la capacidad para procesar muestras desconocidas sin optimización adicional del sistema, la facilidad de sustitución del dispositivo, y preciso, robusto procesamiento de la muestra.
La separación de la muestra y el fraccionamiento es una de las áreas más prometedoras de la aplicación de las tecnologías de microfluidos. Tales etapas de manipulación de la muestra son esenciales para el diagnóstico eficaces clínicos, desarrollo de la terapéutica, los esfuerzos de biovigilancia, y los avances en investigación y tecnología ciencias de la vida. Una miríada de estrategias de separación de microfluidos se han demostrado para partículas y coloides de líquido suspendidas, así como para las especies químicas y biológicas; varios exámenes proporcionan una visión general de los recientes avances y desarrollos en estos campos 1 – 9. Aunque muchas de estas tecnologías de separación de microfluidos (en adelante como "Dispositivos Core") se han caracterizado ampliamente, algunos informes han considerado el problema de la separación de la muestra a nivel de sistema. Los dispositivos básicos suelen ser los chips centímetro escala individual, interconectados con tubos de fluoropolímero, con fluido suministrado por una bomba de caudal o presión.Sin embargo, si la promesa de microfluidos – incluyendo una mayor automatización, fiabilidad y reducción de los volúmenes de muestra – es convertirse en realidad, al menos un esfuerzo equivalente debe dedicarse al diseño de un sistema de separación completa en la que se integra el Núcleo .
Además, un gran desafío para los enfoques de microfluidos a biodetección es la macro a lo micro interfaz. Esto se refiere no sólo a las conexiones físicas "del mundo a viruta" de un dispositivo de microfluidos para componentes macroescala, ya la falta de coincidencia entre los volúmenes típicos de la muestra clínica o analítica (~ 0,1-10 ml) y el volumen interno de chips de microfluidos (~ 0,01-10 l), sino también a las limitaciones de muestreo estadístico derivados de la reducción de estas escalas de tamaño. Estos aspectos contribuyen a la percepción de que la muestra de pre-procesamiento y la preparación son el "eslabón débil" de biodetección. 10 La plataforma descrita en este trabajo takes importantes pasos hacia la solución de esos problemas.
Desde una perspectiva a nivel de sistema, este protocolo se detalla el procesamiento fiable de los volúmenes de escala analítica precisamente-dosificadas (que van desde 0,15 a 1,5 ml) en ~ escalas de tiempo de 10 min. Esta es una operación de "un botón": una vez que el vial de origen que contiene la muestra y de destino viales para la recogida de fracciones se colocan en el sistema, el comando "ejecutar" inicia el procedimiento, y todos los pasos son controlados por computadora. Al final de una carrera, los viales de recogida pueden ser retirados del sistema para el análisis de aguas abajo de las fracciones separadas.
El dispositivo de Core en este sistema es un chip acoustophoresis que extrae partículas (5-20 mM) de células de mamífero de tamaño de la muestra. Separación Acoustophoretic se elige aquí principalmente porque es de alto rendimiento (hasta 100s de l / min), sin etiquetas y sin contacto, ofreciendo así ventajas en la separación de viru viableses a partir de células que pocas otras técnicas de microfluidos pueden igualar. La física de partículas acústica focalización se han descrito ampliamente, 11-13 y no son el foco de este protocolo, pero un breve resumen de los conceptos subyacentes de la siguiente manera para ayudar en la comprensión de la aplicación a la separación de microfluidos.
Ultrasonido ondas estacionarias resonantes en microcanales llenos de líquido producen campos de presión, que dan lugar a las fuerzas que impulsan las partículas hacia los nodos de baja presión. La magnitud de la fuerza depende del volumen de la partícula, y en un factor de contraste acústico derivado de las densidades relativas y compresibilidades de la partícula y el líquido de suspensión. 14 Como tal, centrándose acústica es ideal para la separación de células de tamaño (~ 7-15 m) a partir de (~ de 50-200 nm) partículas similares a virus de tamaño. Las partículas más grandes migran hacia un nodo de presión; sin embargo, ya que la magnitud de la fuerza es muy pequeña paralas partículas más pequeñas de 2-3 micras, estas pequeñas partículas o especies disueltas casi no se mueven en absoluto. Nuestra implementación específica de separación acústica, como se describe anteriormente, 15 incorpora una pared delgada para subdividir el canal de fluido y permite sintonizable, la colocación asimétrica de la posición de enfoque. Esto añade flexibilidad en el diseño de dispositivos y los beneficios, incluyendo aumento de la calidad de desempeño de separación y velocidad se describen con detalle en otro lugar. 16,17
Sin embargo, una ventaja importante del enfoque de diseño a nivel de sistema se describe en este trabajo es que es adaptable a una gran variedad de dispositivos de núcleo de microfluidos. Por ejemplo, la mayoría de los otros modos de separación de flujo continuo, incluyendo inercial, el flujo de campo de fraccionamiento, el desplazamiento lateral determinista (sistema antibloqueo de frenos), y varios tipos de dispositivos electrocinéticos se pueden incorporar fácilmente, con los ajustes apropiados hechos para tener en cuenta cambios en la configuración de entrada / salida , caudales,y volúmenes de muestra. Los dispositivos con varios tipos de campos en-chip (eléctrica, magnética) o gradientes (térmicos, químicos) pueden requerir conexiones adicionales al chip, o la integración de hardware adicional, que da cabida a esta plataforma.
Este protocolo proporciona los pasos necesarios para diseñar un dispositivo de separación de microfluidos, y para fabricar chips de silicio de cristal por una profunda grabado por iones reactivos (DRIE, un proceso de plasma de grabado disponible en muchas instalaciones de microfabricación, que utiliza ciclos de grabado y pasivación alterna para lograr profunda características con paredes laterales verticales 18). A continuación, se describe la caracterización del dispositivo acoustofluidic para determinar los parámetros de funcionamiento óptimas para la separación, y finalmente detalle el sistema de separación totalmente integrada y el procedimiento para el procesamiento de muestras biológicas. Resultados de la caracterización dispositivo típicos y procesamiento de datos de la muestra son luego presentados y discutidos, y de las ventajas clave de este aproada se destacan, incluyendo modularidad, robustez, precisión y automatización.
Este protocolo se presenta la integración a nivel de sistema de dispositivos de microfluidos para equipos macroescala para realizar el procesamiento de la muestra biológica automatizado. La modularidad de esta plataforma permite que sea adaptable a cualquier dispositivo de flujo continuo, y, como ejemplo, el protocolo presentado se centra en la caracterización y la optimización del rendimiento de un dispositivo de separación de partículas acoustofluidic. Tres ventajas principales de este protocolo se destacan: (i) la modularidad y chip a la interconexión mundial, (ii) la caracterización robusta del rendimiento del dispositivo, y (iii) el tratamiento automatizado de los volúmenes de las muestras medidas con precisión para la separación de partículas.
yo. Modularidad y chip a mundo interconexión
Como se muestra en la Figura 2, el chip de microfluidos está montado sobre un tablero a medida para adaptarse fácilmente a una platina del microscopio para la observación directa. El tablero contiene # 6-40 UNF agujeros roscados en una rejilla 5 mm de paso, enaBling el chip para ser asegurado, y las conexiones de fluido que se hará. Las conexiones de fluido se PEEK tubos con extremos mecanizados, que junta contra el chip fluídico con una cara de sellado de junta de goma y un collar de acero inoxidable. Este esquema de interfaz hace que para el reemplazo fácil chip y rápido rediseño dispositivo, que requieren pocos o ningún cambio en otros componentes del sistema, las huellas de chips suministrados cumplen con el formato de cuadrícula. Por ejemplo, hemos utilizado esta plataforma con chips de microfluidos para la electroforesis de flujo continuo, la lisis celular térmica, 29 mezclado rápido de los reactivos para la síntesis química, y la captura de una sola célula y el interrogatorio.
ii. Caracterización robusta del rendimiento del dispositivo
Con el fin de optimizar el rendimiento de cualquier dispositivo de separación de microfluidos, su funcionamiento primero debe caracterizarse completamente. El sistema descrito aquí apoya el desarrollo de protocolos rápidos y automatizados para hacer esto. Para el examp específicale de dispositivos acústicos de enfoque, la calidad centrándose, frecuencia de operación, y la posición de las partículas se centraron en el canal de microfluidos debe medirse para cada dispositivo individual. Estas medidas requieren barriendo a través de una gama de frecuencias de accionamiento piezocerámico, voltajes y velocidades de flujo, para identificar las combinaciones óptimas de los parámetros para la separación de alta calidad. El protocolo presentado varía automáticamente estos parámetros ajustables y captura la relevancia de datos, es decir, las imágenes fluorescentes de las partículas que fluyen en el canal que son post-procesado para generar las mediciones requeridas de partículas de enfoque de la calidad, la frecuencia y la posición (Figura 3).
Caracterización completa del rendimiento del dispositivo acústico requiere repetir los pasos 4.4 y 4.5, según sea necesario en diferentes condiciones experimentales. Por ejemplo, la posición de enfoque absoluta de un chip se encuentra mediante la ejecución del barrido de frecuencias a velocidades de flujo relativamente bajas y alto voltajes para asegurar la migración completa a la ubicación de nodos. Además, tales exploraciones de frecuencia pueden evaluar la calidad de montaje de dispositivo (cuando se ejecuta con perlas de poliestireno de tamaño conocido), o para determinar cómo un tipo de partícula previamente desconocido se comportará en el sistema (después de un chip se ha caracterizado con los granos). Un chip con buena transferencia de energía desde el piezocerámico al canal de microfluidos se traducirá en apretada centrándose a velocidades de flujo altas (> 1 ml / min) y los voltajes bajos (12-15 V PP), mientras que aquellos con transferencia de energía pobres no se centrará incluso a bajas velocidades de flujo (<100 l / min) y altos voltajes (> 20 V pp). Hemos encontrado que el contacto íntimo entre el chip microfluídico y el piezocerámico es crítico para la transferencia eficiente de la energía en el fluido. La investigación adicional del método óptimo de la unión del chip de microfluidos y el piezocerámico permitirá la producción fiable de dispositivos de alto rendimiento.
Por último, una completala imagen de la operación de un dispositivo de acoustophoretic se puede obtener mediante la combinación de las mediciones de barrido de frecuencia basados en imágenes de la Etapa 4 (y en la Figura 3) con recuentos de partículas recogidas de la SPO y LPO como funciones de los parámetros de funcionamiento pertinentes, a partir de los experimentos de separación llevadas a cabo con microesferas , como se describe en el Paso 5. Como se muestra en la Figura 6, una serie de experimentos automatizados, puede caracterizar rápidamente el rendimiento y la capacidad de ajuste de un dispositivo individual, informando al usuario del espacio óptimo de parámetros para operar el dispositivo para la separación de partículas.
iii. Automatizado de procesamiento a pequeña muestra para la separación de partículas
Para el procesamiento de muestra basada en chip microfluídico éxito y exacta, es crítico para metro, la carga, entregar de forma fiable y precisa, y recoger los volúmenes de fluido a medida que pasan a través. Esta precisión es especialmente importante cuando el volumen de muestra es pequeño(~ 0,1-1 ml), que es común en entornos de laboratorio clínico o de investigación. 30 manipulación de la muestra precisa es un reto en los experimentos de microfluidos tradicionales que emplean la retirada manual de la muestra en una jeringa y la infusión en un dispositivo sin votaciones de cuando la muestra se ha separado y cuando se debe recoger. El protocolo presentado emplea automatizado muestra bobina de carga y despacho junto con información en tiempo real de sensores de flujo para permitir separaciones reproducibles de pequeños volúmenes de muestra.
La Figura 5 muestra los perfiles de flujo medido en la SPO y LPO de un experimento de separación típico. En primer lugar, tampón líder de al menos 35 l se carga para asegurar un flujo estable antes de la muestra alcanza el chip acústico. Los volúmenes de muestra de menos de 100 l no se recomiendan para esta configuración del sistema, debido a dilución de la muestra debido al tampón líder se hace excesiva. Un enchufe de aire se utiliza al principio de THe inyección antes de la memoria intermedia que conduce a separar el bloque de muestra del fluido que sigue, la prevención de la mezcla y dilución de la muestra y servir como un indicador para los sensores de flujo. Después de un transitorio inicial como el líquido comienza a moverse a través del sistema, las señales de punto sostenido en ambas salidas indican el paso de la primera burbuja de aire. Estos transitorios son seguidos por un largo período de flujo estable como la muestra fluye a través del sistema, y luego otro pico cuando pasa la segunda burbuja de aire, y finalmente una disminución eventual de la tasa de flujo a cero después de la bomba se detiene jeringa.
El paso de los tapones de aire a través de los sensores de flujo se utiliza como puntos de activación para cambiar las válvulas para iniciar y detener la recogida de muestras, minimizando así la muestra perdido y la dilución por volúmenes de fluido no muestra. Medición de bucle cerrado de los volúmenes de muestra procesada elimina la necesidad de volver a programar estos valores antes del inicio del experimento cada vez que se cambia la muestra de entrada. Esta característica esparticularmente importante cuando el volumen de muestra es limitado, por ejemplo en el caso de muchas muestras clínicas. Monitoreo de flujo en tiempo real también ayuda en la solución de problemas; una mala racha (por ejemplo, la formación de una obstrucción en uno de los puntos de venta) es inmediatamente evidente a partir de los perfiles de flujo resultantes, como en la Figura 5b.
Para demostrar la flexibilidad y la eficacia de la separación acoustofluidic utilizando la arquitectura del sistema presentado, DENV purificado y reservas de virus GGV se clavó en acciones celulares y separados por el procesamiento a través del chip de microfluidos. Figura 7a muestra que las células Raji fueron bien separados, de los virus, como 97 % de las células Raji que salen del chip se encontró que en el LPO, dejando de ese modo una muestra altamente enriquecido de DENV en el SPO. En comparación, la eficiencia de la separación DENV fue menor, con 70% de DENV que sale el chip se encuentra en la SPO. Esto se puede atribuir a una ligera mezcla convectiva inducida por las vueltas de la separatien el canal, pero más probable que algunas partículas DENV que migran junto con las células Raji en el LPO. Las células que migran lateralmente a través de líneas de corriente arrastra un poco de líquido con ellos, incluso a bajo número de Reynolds. Por este mecanismo, así como la adsorción superficial no específica, las partículas virales de transferencia en la LPO. Sin embargo, la muestra altamente enriquecido de DENV en el SPO es un beneficio significativo, por ejemplo, cuando se utiliza la secuenciación de novo para detectar e identificar virus.
La figura 7b muestra que en una carrera experimental, sólo alrededor del 70% de las células Boa que salen del chip se encontraron en la LPO, en comparación con casi el 100% de eficiencia de separación para células Raji. La diferencia en el rendimiento de separación entre los dos tipos de células puede ser atribuible a un tamaño medio menor o una menor densidad de células Boa comparación con las células Raji, por lo tanto, lo que resulta en fuerzas acústicas más pequeñas. Para confirmar o refutar estos supuestos, el tamaño, la densidad y morfología de Boacélulas en suspensión (que normalmente crecen adherente) de las células de la boa se deben medir con precisión, un esfuerzo para una mayor investigación. En los mismos experimentos, de manera similar a los experimentos con DENV, el grueso de la GGV recuperado salido del SPO, lo que indica un enriquecimiento de la fracción viral.
Los datos presentados ponen de relieve los desafíos inherentes a la ingeniería plataformas de amplia aplicación para el procesamiento de una variedad de muestras biológicas. Es importante destacar que las interacciones biológicas pueden empezar a jugar tan grande un papel como los efectos físicos y mecánicos. Sin embargo, estos experimentos preliminares demuestran también el poder y la promesa de utilizar esta arquitectura del sistema para el procesamiento de muestras en aplicaciones clínicas y de investigación. Como sistema de ingeniería robusta, bien caracterizado, esta plataforma ofrece la posibilidad de buscar respuestas a nuevas preguntas científicas.
The authors have nothing to disclose.
This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL’s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly | |||
Double Sided Polished Silicon Wafer | Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA | 100 mm <100> prime wafer | 1-20 ohm-cm, 495 +/- 25µm Double-side polished |
Glass Wafer | Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA | 100mmx0.5mm Boro | |
Photoresist, AZ 1518 | MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany | AZ 1518 | Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching |
Photoresist, AZ 4620 | MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany | AZ 4620 | Photoresist to define fluidic and via mask patterns |
DRIE plasma etcher | STPS, Newport, NP, United Kingdom | Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system | |
Wafer Bonder | Electronic Visions Group, St.Florian am Inn, Austria | EVG 501 | |
Dicing saw | Kulicke & Soffa Industries, Singapore | K&S 982 | |
Epoxy kit | Epoxy Technology, Billerica, MA, USA | EPO-TEK 301 | Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip |
PZT piezoceramic | Piezo Systems, Woburn, MA, USA | PSI-5A4E | 37.5 × 10 × 0.5 mm |
28 AWG Kynar-insulated solid wire | Squires Electronics, Cornelius, OR, USA | UL1422 | |
2-part silver epoxy | MG Chemicals, Surrey, BC, Canada | 8331 | Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT |
L-edit | Tanner EDA, Monrovia, CA, USA | Ledit v15.1 64-bit | CAD software for mask layout |
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance | |||
Dual Pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD ULTRA Series, 703007 | |
5ml syringes | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 309646 | |
Luer to Threaded port adapter | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-659 | Connects syringe to tubing |
Union | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-623 | Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing. Can also use webbed |
Ferrule 1/4-28 flat bottom | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-200 | Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware |
Nut 1/4-28 flat bottom | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-202 | Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware |
1/16" OD Fluoropolymer tubing | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1912L | Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections. Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L). |
Small ID fluoropolymer tubing | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1476-20 | Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP |
PEEK tubing | Connects from chip to fluoropolymer tubing. | ||
Cooling fan | Multicomp, Leeds, England | MC19663 | |
Function Generator | Agilent, Santa Clara, CA, USA | 33220A | |
RF amplifier | ENI, Rochester, NY | 325 LA | Must be able to amplify signals from <1V in the range of 1-2MHz to 25 Vpp to the piezo. |
CCD Camera | Photometrics, Tucscon, AZ, USA | CoolSnap HQ | |
Inverted Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Axiovert S100 | |
FITC filter set | Chroma Tech, VT, USA | SP101 | |
Objective, 10x | Zeiss, Oberkochen, Germany | ACHROPLAN | |
Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, OR, USA | TDS3014B | To monitor voltage output by RF amplifier |
MatLab | Mathworks, Natick, MA, USA | R2014a | |
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW | R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA | SITK | |
Tween 20 | Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA | P9416 | |
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads | Bangs Laboratory, IN, USA | FS06F | |
Additional materials required for Step 5: Automated Separation | |||
Multiport valves | VICI, Houston, TX, USA | C25Z-3180EUHA | In the current configuration 4 valves are needed |
Flow Sensors | Sensirion, Westlake Village, CA, USA | SLI-1000 | |
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1902L and 1912L | High purity PFA preferred |
Nut | VICI, Houston, TX, USA | ZN1PK-10 | Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10 |
Ferrule | VICI, Houston, TX, USA | ZGF1PK-10 | Used with nut to make connections between tubing and valves. |
LabVIEW | National Instruments, Austin, TX, USA | LabVIEW Professional Development system | Laboratory Automation Software |
PBS | Teknova, Hollister, CA, USA | P0200 | |
Raji Cells | ATTC, Manassas, VA, USA | CCL86 | |
Boa Cells | Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF | ||
GGV | Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF | ||
DENV | Kindly provided by Jose Pena at LLNL | ||
Coulter Counter Z2 | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Z2 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific, Waltman, MA, USA | 0267151B |