Une plate-forme microfluidique pour le traitement de précision de petit volume échantillon et son utilisation pour Taille séparer les particules biologiques avec un Microdevice acoustique

1. Acoustophoretic conception de l'appareil et mise en page Photomask REMARQUE: Considérations générales et des conseils pour la conception de processus de microfabrication et masque mise en page peut être trouvé dans les textes sur la microfabrication et des tutoriels de conception de photomasques 19 – 21. Disposez Masque 1, la couche fluidique (face avant), en utilisant un logiciel de CAO approprié. Choisir une géométrie qui permet l'injection d'échantillon et de séparation approprié pour l'application souhaitée. Pour acoustique de focalisation, définir la largeur de canal fluidique w pour fournir une fréquence de résonance f n supérieure à 1 MHz en fonction de l'équation f n = nc / 2w, où c est la vitesse du son dans le fluide concerné et n est le nombre de noeuds d'ondes stationnaires (par exemple, par un large canal de 900 pm, le deux résonance noeud est attendue à f 2 = 1,65 MHz). REMARQUE: particuless occupant des positions latérales distinctes près de l'extrémité du canal de séparation devrait quitter sorties distinctes. Dans ce protocole, les particules sont séparées selon la taille, de sorte que les sorties sont désignées SPO LPO, de petites particules et de grandes particules sortie, respectivement, comme représenté sur la figure 1. Régler la longueur de canal de fluide pour commander la longueur de temps de particules sont exposées à la matière de séparation à un débit spécifique. Plus sur puce temps de séjour pour les particules de migrer en raison de forces de séparation doit être troqué contre l'empreinte plus grande de la puce nécessaire. NOTE: Dans nos appareils acoustiques de focalisation, le canal d'écoulement fait trois passes en bas de la puce pour l'augmentation du temps de séjour (Figure 2a). À un débit total typique de 200 pi / min, les particules circulant dans le 300 x 200 um section transversale, le canal longue séparation de 117 mm dépenser en moyenne 2,1 s dans le domaine acoustique. Inclure les ports fluidiques dans le layo de masqueut pour les connexions à tube norme disposés sur une grille standardisée (5 mm pitch). Inclure les points repères appropriés pour l'alignement des masques les uns aux autres au cours de la fabrication et de découpage en dés dispositifs individuels. Disposez Mask 2, la couche Via (de dos), qui ne comprend que les ports fluidiques. Inclure points repères pour l'alignement de masque 1. Figure 1. Dispositif Acoustofluidic. Sketches schématiques d'architecture de dispositif acoustophoretic. (A) Vue d'en haut, montrant la configuration globale H-filtre (pas à l'échelle). (B) Schéma de la section de canal à l'emplacement marqué par la ligne noire pointillée en (a), montrant le champ de pression (bleu pointillés), et le sens des forces acoustiques primaires de rayonnement (PRF) qui poussent les particules vers plans nodaux (flèches rouges). La section transversale de canalest de 900 × 200 um avec un mur d'environ 10 um d'épaisseur séparant la principale (300 m de large) et des canaux de dérivation. (C) de la représentation 3D de la séparation des particules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 2. salle blanche fabrication de puces microfluidiques pour Acoustophorèse Motif les orifices de fluide de retour du côté de l'aide Mask 2 sur une double-face polie de 0,5 mm d'épaisseur, 100 mm de diamètre <100> plaquette de silicium par la norme photolithographie positive résister. Etch par cette géométrie profonde gravure ionique réactive (DRIE) à une profondeur de 350-400 um. Tournez sur la plaquette, et la géométrie de canal de fluide motif l'avant-côté en utilisant le masque 1 par la norme positive résister à la photolithographie sur l'autre côté du silicium. Ensuite, monter la plaquette de l'appareil à une seconde (silicium vierge) porteuse tranche en utilisant résine photosensible. Graver les canaux, également par DRIE, jusqu'à une profondeur de 200 um, par gravure du silicium dans les emplacements de ports (la plaquette de support afin de protéger la surface de l'outil de DRIE). De-montage de la tranche de l'appareil à partir du flan tranche de silicium par trempage dans une solution de décapage de résister. Nettoyer la tranche de l'appareil et une tranche de 0,5 mm d'épaisseur en verre borosilicate sans relief en utilisant une solution Piranha (acide sulfurique et de peroxyde d'hydrogène dans un rapport de 3: 1). Sceller les canaux de fluide par liaison anodique des plaquettes de verre et de silicium en utilisant les paramètres suivants: pression de la chambre à 3 mTorr, la pression de piston à 1000 N, de la température à 350 ° C, et appliquer 750 V jusqu'à ce que le courant chute en dessous de 0,2 mA. Couper les puces individuelles à part avec une lame de diamant sur une scie de découpage en dés. 3. Dispositif d'assemblage final Capteur piézo-jointe NOTE: L'échographie est généré dans la puce microfluidique par un transducteur piézo-céramique fixé sur le côté de silicium. De àwo-composante kit époxy à faible viscosité, peser le ratio recommandé des deux composants et les mélanger soigneusement. Répartir le mélange époxy avec une pipette et répartir uniformément à travers un zirconate titanate de plomb (PZT) piézocéramique pour créer une fine couche (environ 10 pi de mélange époxy pour un piezo avec des dimensions de 37,5 x 10 x 0,5 mm). Utilisation d'un bâti ou gabarit approprié, aligner le côté époxy de la piézocéramique avec la puce microfluidique, fournissant une zone en surplomb sur un côté pour fixation de fil suivant (voir Figure 2a), et de rapprocher les deux éléments en contact. Serrer l'ensemble dans un étau, en prenant soin de ne pas craquer l'un des composants, et de guérir à la température et la durée recommandée par le fabricant époxy. Après l'époxy a durci, attachez bien-fil de calibre conduit à chaque côté de la piézocéramique, en soudant avec un fer à souder fine pointe, ce qui rend le contact plus brève possible avec le piézo pour éviter thermally dé-il polarisant. Sinon, utilisez un adhésif conducteur de coller fils à la piézo. Figure 2. fluidique Breadboard, Chip montage et mondiale à puce Interface. Photos de (a) la puce microfluidique acoustique (dimensions extérieures de 70 x 9 x 1 mm) avec attachés des fils conducteurs de transducteur piézoélectrique, montrant trois passes de la séparation canal descendant la puce, (b) les vissages fluidiques personnalisé et des composants de tubes usinés pour l'interface puce-à-monde, (c) la puce montée sur la face inférieure de la planche à pain fluidique en utilisant des dispositifs de serrage, couvrant une ouverture dans la carte de test pour permettre ventilateur de refroidissement, (d) une vue de dessus de la planche à pain avec des connexions de tuyaux attachés et ventilateur de refroidissement, et (e) une coupe schématique des raccords vissés cette interface l'Tubing avec la puce microfluidique monté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Dispositif de montage et World-To-Chip Interfacing Fixez la puce à la "planche à pain fluidique» (une plaque avec une grille de régulièrement espacées filetée trous traversants) en utilisant des dispositifs de serrage. Joindre un ventilateur de refroidissement pour la carte de test pour réguler la température au cours des expériences acoustiques (voir la figure 2). NOTE: Le fonctionnement sans ventilateur de refroidissement à des tensions typiques d'entraînement augmente la température de l'appareil à 70-80 ° C. Cela déplace de manière significative la fréquence de résonance due à la vitesse du son dans le fluide modifiée, et peut avoir un impact négatif sur la viabilité de toutes les particules biologiques en cours de traitement. Visser connecteurs puce-à-monde, précédemment décrit ailleurs 22 et illustré à la figure 2. Joindre à ces itubes de NTERFACE à tube supplémentaire sur les entrées et sorties à l'aide de la norme ¼ "-28 syndicats pour 1/16" tube. 4. Caractérisation des performances de mise au point acoustique REMARQUE: Les composants du système requises pour la caractérisation acoustique concentrant sont regroupés dans la liste des matières. Les étapes 4.1 et 4.2 ci-dessous concernent toutes les Core utilisé avec cette plate-forme, que les étapes suivantes décrivent les opérations spécifiques à l'appareil acoustofluidic discuté ici. Configuration du système Assemblez la puce microfluidique en utilisant des connexions dans le monde à puce sur la carte de test fluidique, comme décrit dans la section 3. Les connexions de rendre l'utilisation des tubes (comme 1/16 "de tube de polymère fluoré de diamètre extérieur) à un fluide flacons de pompe et de collecte. Monter la planche à pain sur la scène d'un microscope capable de l'imagerie de fluorescence équipé d'une caméra CCD. Connectez longueurs de petite diamete intérieurer (ID) tube (0,006 "est recommandé) immédiatement après la puce (voir la figure 4) pour servir de réducteurs de débit, qui stabilisent le système et contrôlent le fractionnement du flux entre les sorties de la puce. Utiliser des tubes plus grands d'identité, telles que 0,01 "ou 0,03", pour toutes les autres connexions. Estimer la résistance à l'écoulement hydrodynamique R h de chaque morceau de tube de longueur L et de diamètre interne D en utilisant l'équation R = h 128 ul / nD 4, où μ est la viscosité dynamique du fluide. La chute de pression Δ P revenant à chaque longueur de tube à un débit donné Q est donnée par Δ P = QR h. Choisir un rapport de longueur de restriction de diviser l'écoulement entre les sorties en fonction de la méthode de séparation utilisée. Séparation optimale avec les puces acoustiques dans ce protocole nécessite un SPO: rapport d'écoulement de la LPO approximationtement 65: 35%. Choisir la longueur des limiteurs d'écoulement de sortie de telle sorte que leur résistance fluidique est au moins 3-4 fois plus grande que la résistance totale dans le reste du système (additionné de façon appropriée en série ou en parallèle). Pour le dispositif de acoustophorèse utilisée dans ce travail, longueurs de tubes de 35 et 65 cm pour la LPO et le SPO sont adaptés. REMARQUE: Une attention particulière doit être accordée à R h de toute base dispositif microfluidique. Pour notre acoustique concentrant puce dans ce travail, R h est faible en raison de ses dimensions relativement importantes de canal, de sorte que les résistances de la tubulure connectés facilement dépasser il. Pour les appareils avec des dimensions de canaux plus petits, la résistance de la puce peut dominer le reste de la tubulure du système, dans lequel la conception de cas et le contrôle de sur puce canal R h est une considération additionnelle lors de l'étape 1 du présent protocole. Principes et lignes directrices de conception détaillées sont disponibles dans la littérature. 23,24 Vérification du système Vérifier les fuites pour vérifier que le dispositif microfluidique présente pas de défauts et toutes les connexions de tuyaux sont scellés. Distribuer de l'eau à travers les tubes d'entrée en fonction des besoins avec une seringue et pour surveiller toute fuite de fluide dans le canal principal. Distribuer un volume connu par la puce, et de mesurer les volumes collectés à partir des sorties pour garantir que le rapport d'écoulement est tel que prévu. Les écarts par rapport au rapport de volume escompté peuvent indiquer des blocages dans l'une des sorties ou des connexions qui fuient. Pour maintenir la propreté du système et éviter le colmatage rincer l'ensemble du système (tubulure fluidique et puce) avec des solutions de nettoyage appropriés (par exemple, l'eau de Javel, l'éthanol, de l'eau) avant et après l'exécution des expériences. Dans le cas de sabots ou des blocages dans l'un des points de vente, rincer le système tout en branchant la sortie claire pour dégager le blocage. Si cela échoue, inverser le sens d'écoulement pendant le rinçage,éventuellement l'application d'impulsions rapides de flux inverse (à l'aide d'une seringue actionnée manuellement). Enfin, si le blocage ne peut toujours pas être retiré, remplacer le tube ou puce, si nécessaire. Fréquence configuration de numérisation pour la focalisation acoustique Remplir le canal de dérivation (voir figure 1) avec un fluide tel que l'eau désionisée, de l'éthanol, ou une solution saline tamponnée phosphate (PBS) par injection avec une seringue manuelle. Notez que ce fluide ne vient pas en contact avec l'échantillon en cours de traitement. Les détails de réglage de la position de noeud en utilisant différents fluides de contournement sont décrites ailleurs 16,17. En résumé, si le noeud doit être plus proche de la paroi de séparation, en utilisant un fluide de dérivation de plus faible densité, tel que l'éthanol; destiné à être placé plus près de noeud dans le flux d'échantillon d'entrée, pour choisir un fluide plus dense, par exemple une solution de glycérol. Ajouter une solution de talon d'environ 0,01% (p / v) de billes fluorescentes 5-8 um de polymère en suspension dans un tampon tel que PBS avec0,05% de Tween-20 et remplir la seringue d'entrée d'échantillon avec la solution de talon. Remplir la seringue d'entrée de la mémoire tampon avec le même tampon (ceci ne doit pas nécessairement être le même fluide que dans le canal de by-pass). A noter que, en général, le tampon est choisi pour convenir à l'application (voir étape 5.1). Avec la carte de test fluidique sur la platine du microscope, se concentrer à mi-chemin dans la profondeur du canal à une région de canal droite juste avant la sortie avec les deux canaux (séparation et de dérivation) dans le champ de vision. Une source supplémentaire de lumière externe oblique-angle peut être tenu de rendre les parois du canal visible, pour la réussite de post-traitement des données d'image. Scan Fréquence automatique et de capture d'image Effectuer les connexions électriques à l'aide de câbles blindés (par exemple, RG-58 équipé de connecteurs BNC) à un générateur de fonction avec la fréquence radio (RF) amplificateur pour délivrer le signal d'excitation au transducteur piézoélectrique. Eventuellement, utiliser un oscilloscopela sortie du générateur de fonction pour la surveillance de la tension réelle appliquée au transducteur. Allumer le ventilateur de refroidissement, et régler le générateur de fonction de telle sorte que la sortie de l'amplificateur RF au transducteur piézo-électrique est dans la gamme de 12 à 25 volts crête-à-crête (V pp). Régler les deux seringues à la même vitesse d'écoulement comprise entre 50 et 200 pl / min. En utilisant une pompe à seringue unique pour entraîner deux seringues avec le même moteur il est recommandé de réduire au minimum les perturbations de l'écoulement. Effectuer une procédure de balayage de fréquence en spécifiant les début et de fin des fréquences, la taille de l'étape entre les valeurs de fréquence et la tension de commande piézo utilisant une trousse d'outils d'automatisation de laboratoire tels que LabVIEW de National Instruments. A chaque étape de fréquence, appliquer la tension pendant 15 secondes pour permettre au système à l'équilibre, puis de capturer 10 images de perles qui coule à travers la puce pour une analyse ultérieure (temps d'exposition entre 10 et 100 ms sont recommandés). Entre ehaque appliquée pas de fréquence, éteignez la tension pendant environ 20 secondes pour laisser les perles redistribuent uniformément à travers le canal et éliminer les préjugés en mettant l'accent de l'étape de fréquence précédemment appliquée. Analyse d'image pour déterminer la fréquence de résonance et en se concentrant Position Exécuter un script d'analyse d'image (comme le script AF_freqScanPlotter.m MATLAB fourni avec ce protocole) et entrez les informations requises aux invites: sélectionnez la liste des fichiers d'image générées à l'étape 4.4, entrez le début de balayage et arrêter les fréquences et la taille de l'étape, la largeur de la voie, l'emplacement du mur, et enfin sélectionner la zone d'image à analyser, y compris à la fois la séparation et des canaux de dérivation. Observer la moyenne de script analyse l'ensemble des images capturées à chaque pas de fréquence, et la moyenne des valeurs d'intensité le long de la direction d'écoulement. Il en résulte une section transversale de balayage ligne de l'intensité de fluorescence. REMARQUE: La fréquence correspondant à la highe st intensité est définie comme la fréquence de résonance (figure 3, rangée du milieu), et la position dans le canal où la plus haute intensité se produit est la position de focalisation (Figure 3, rangée du bas). Figure 3. Représentant balayage en fréquence. Exemple de données de balayage de fréquence pour bien couplé (A) et mal couplé (B) et piézo puce. Rangée du haut: l'intensité de fluorescence des perles (rouge représente élevée, et le bleu représente faible intensité). Rangée du milieu: intensité maximale à chaque fréquence. Rangée du bas: l'emplacement de l'intensité maximale, où la ligne pointillée rouge indique prédit position de focalisation, et les diamants rouges indiquent la fréquence de résonance telle que déterminée par l'intensité maximale.g "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 5. Séparation automatique NOTE: L'expérience de séparation automatisé est exécuté pour séparer les grosses particules de petites particules en raison des acoustiques concentrant forces de taille dépendant appliquées dans la puce microfluidique. Les composants du système requis sont regroupés dans la liste des matières. Configuration du système et la préparation d'échantillons Se connecter la puce microfluidique de la pompe à seringue, les soupapes de sélection multi-port contrôlés par l'ordinateur, débitmètres PC-interface, et un tube, comme représenté sur la Figure 4. Cette configuration permettant le traitement d'échantillons automatisé à travers la puce de séparation microfluidique, ainsi que automatisées étapes de nettoyage entre les expériences pour éliminer la contamination croisée et l'échantillon report. Utiliser un tampon d'échantillon appropriés pour les cellules ou les particules à séparer, ou tel que requis par l'analyse de dosageêtre utilisés après la séparation. Comme à l'étape 4.3.2, le tampon de récupération (mais pas nécessairement du fluide de by-pass) doivent correspondre à l'échantillon de fluide. REMARQUE: Tous les tampons aqueux habituellement utilisés avec des échantillons biologiques (par exemple, PBS) ont des propriétés acoustiques semblables à l'eau et ne changera pas sensiblement la performance du dispositif acoustique. L'utilisation d'échantillons de fluides avec densité et la viscosité significativement différente de l'eau est possible, mais seulement recommandé pour les opérateurs ayant une expérience significative acoustophorèse. Figure 4. Configuration du système acoustique pour les expériences de séparation automatisé. Les lignes bleues retracer la voie principale d'écoulement à travers le système. Toutes les lignes vertes et noires sont 0,03 "de diamètre interne (ID) des tubes, et toutes les lignes bleues et grises de couleur sont de 0,01" tube ID, avec le eXception des bobines de maintien, qui sont 0,03 "ID, et les réducteurs de débit, qui sont 0.006" ID. Les seringues sont remplis avec le tampon, et les bobines de maintien avoir un volume suffisant (550 pi) pour empêcher l'absorption de tous les échantillons ou des réactifs de nettoyage dans les seringues. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Séparation procédure État de pré-terme. Avant d'exécuter la séparation, veiller à ce que les réservoirs de réactifs de nettoyage (eau de Javel, l'éthanol, tampons) ont suffisamment de liquide, les réservoirs de déchets ne sont pas pleins, et les lignes fluides sont amorcées (ie, rempli de solution). Si cette dernière condition est incertain, ou si le système est en cours d'exécution pour la première fois après la marche au ralenti (par exemple, la première fois sur un jour donné), exécutez une procédure de nettoyage automatique (voir l'étape 5.3 ci-dessous). Réglez Vannes 3 et 4 à la sortie de la puce à l'écoulement à perdre Thérèservoirs départ. Allumez le ventilateur de refroidissement, et régler le générateur de fonction à la fréquence de résonance pour la puce acoustique étant utilisé, tel que déterminé à l'étape 4.5. Réglez le point de consigne de tension sur le générateur de fonction de sorte que les sorties de l'amplificateur RF entre 12 et 25 V pp, le cas échéant pour la séparation souhaitée. Connectez l'entrée de l'échantillon Vial, tampon d'entrée Vial, et les flacons de collecte appropriés pour le système. Juste avant de fixer le flacon de Exemple d'entrée à son tube de ramassage, vortex brièvement flacon pour remettre en suspension les particules qui pourraient se sont installés. Ensuite, fixez le flacon et d'initier la routine de séparation sans délai. ATTENTION: Si l'échantillon à traiter contient des agents potentiellement infectieux, les flacons doivent être d'un type vis-dessus, afin de maintenir un système étanche et empêcher l'échantillon d'aérosol. En outre, lorsque vous travaillez avec des matières biologiques dangereuses, gérer tous les flacons et tubes tout en portant l'équipement de protection nécessaire et l'aide de la reqcontrôles et procédures de danger uired pour le Groupe des risques biologiques et de niveau de biosécurité appropriées pour le matériau. Consultez les politiques et protocoles institutionnels en cas d'incertitude. Utilisez un programme dans une boîte à outils d'automatisation de laboratoire pour contrôler les valves, capteurs de débit et de la pompe pour effectuer la routine de séparation entièrement automatique. NOTE: La routine commute les vannes, actionne la pompe seringue retrait et de perfusion, et moniteurs de flux de données capteurs pour chronométrer correctement la collecte de fractions d'échantillons de sortie. Les principales étapes sont résumées ci-dessous dans 5.2.4.1 travers 5.2.4.3, que si elle est effectuée manuellement. Premier tube de ramassage. Retirer environ 15 pi de l'entrée flacon d'échantillon pour remplir complètement le tuyau de raccordement à Valve 1. Simultanément, le premier tube reliant la Vial tampon d'entrée à la valve 2. De la même manière, le premier l'entrée d'air de Valve 1 à veiller à ce qu'il ne contient pas de fluide. Enfin, passer Vannes 1 et 2 pour expulser de gaspillerl'excès de liquide ou de l'air qui est entré dans la bobine de chargement. Charger la bobine d'échantillon, comme représenté sur la figure 5a. Une séquence de chargement typique de traitement d'un échantillon de 250 ul est de retirer 25 ul d'air à 50 ul / min, puis 250 ul d'échantillon à 200 ul / min, suivi par 35 pi de premier tampon à 200 ul / min, et enfin encore 25 pi d'air à 50 pl / min. NOTE: Tous les volumes et débits sont sélectionnables par l'utilisateur. Notez que cette séquence de chargement est dans l'ordre inverse de la façon dont les bouchons fluides iront à travers le dispositif de séparation. Commencez perfusion échantillon. Régler les pompes à seringues pour infuser les bouchons fluide chargé à la vitesse souhaitée (typiquement 100 pi / min). Surveiller les débits à la SPO LPO et avec des capteurs de débit pour garantir que l'écoulement est stable et à un rapport déterminé à l'étape 4.1, et que le colmatage n'a pas eu lieu. Recueillir des fractions séparées. Lorsque les capteurs de flux détectent un pic de débit, indiquant paSsage du premier entrefer, passer la vanne de sortie correspondant à partir de déchets (où il a commencé à l'étape 5.2.1) à un prélèvement d'échantillons flacon. Après passage de l'échantillon à partir de la puce, d'observer le détecteur d'écoulement détecte le second entrefer. À ce stade, mettez les vannes de sortie de retour à perdre. Après le volume complet chargé de l'étape 5.2.4.2 est distribué, arrêter la perfusion de la pompe de la seringue et mettre fin à la routine d'automatisation lorsque le débit atteint zéro. Après l'expérience de la séparation est terminée, débranchez le SPO et les flacons de prélèvement d'échantillons LPO et de les stocker de manière appropriée pour une analyse ultérieure. Automated nettoyage et de décontamination NOTE: Avant de traiter chaque échantillon, rincer et décontaminer l'ensemble du système fluidique en utilisant la routine automatique suivante. Fixez le SPO et tubes collection de flacons LPO, ainsi que le tube échantillon de ramassage dans des flacons vides de collecter des solutions de nettoyage excédentaires qui seront vidées throuGH tubes. Lancer la routine de nettoyage du système automatisé. Comme avec la procédure de séparation automatisée à l'étape 5.2, le programme devrait contrôler les soupapes et pompe seringue séquentiellement charger la bobine de maintien avec des réactifs de nettoyage, et rincez-les à travers le système. Effectuer la routine de nettoyage suivante: ras de Javel à 10%, puis avec 70% d'éthanol, et se terminer par l'eau ou un tampon salin approprié (par exemple, 1x PBS ou le tampon utilisé pour le traitement de l'échantillon). Utilisez les volumes de chasse suivants: 450 pi pour l'eau de Javel et de l'éthanol, et 1000 ul d'eau / tampon. Au cours des étapes de rinçage, vider chaque réactif dans le SPO tandis que la vanne de sortie LPO est réglé sur un port qui est bloqué, alors vice-versa, pour retirer toute obstruction potentiels dans les réducteurs de débit de sortie. Maintenir retrait et de débit de perfusion de 300 à 500 ul de taux / min afin de minimiser la génération de bulles dans le tube et l'accumulation de contre-pression lorsque soit le SPO ou la LPO est bloquée. Discard les solutions de rinçage en excès et les flacons dans lesquels ils collectées en suivant les procédures appropriées pour la manipulation des déchets biologiques ou chimiques.