Микрожидком Платформа Точность Малый объем пробы обработке и использовании в биологических Размер Отдельные частиц с акустической микроустройство

1. Acoustophoretic Дизайн устройства и Photomask Макет ПРИМЕЧАНИЕ: Общие соображения и рекомендации для проектирования процесса микротехнологий и макет маски можно найти в текстах на микротехнологий и учебники дизайна фотошаблона 19 – 21. Выложите Маска 1, жидкостный слой (лицевая сторона), с использованием соответствующего программного обеспечения CAD. Выбрать геометрию, которая позволяет вводимого образца и разделение подходящую для требуемого применения. Для акустической фокусировки, установите струйный ширину канала W, чтобы обеспечить резонансную частоту F N больше, чем 1 МГц в соответствии с уравнением F N = пс / 2w, где с скорость звука в соответствующем жидкости и п число стоячих волн узлов (например, для широкого канала 900 мкм, двух- узел резонанс ожидается на F 2 = 1,65 МГц). ПРИМЕЧАНИЕ: ЧастицаS занимая различные позиции боковые ближе к концу канала разделения должны выйти из различных точек. В этом протоколе, частицы отделяются от размера, так что выходы обозначены SPO и LPO, при малых частиц и выхода крупных частиц, соответственно, как показано на рисунке 1. Установите длину канала для жидкости, чтобы управлять длина частиц времени подвергаются области разделения на определенной скорости потока. Более на чип время пребывания частицы мигрировать из-за разделения сил должно быть проданы с учетом увеличения требуемого чипа след. ПРИМЕЧАНИЕ: В наших акустических устройств, направленных, канал потока делает три прохода вниз обломок для увеличения времени пребывания (рис 2а). В типичной общей скорости потока 200 мкл / мин, частиц, проходящих через 300 х 200 мкм поперечного сечения, 117 мм длиной канала разделения проводят в среднем 2,1 сек в акустическом поле. Включить жидкостных порты в маске Layoут для подключения к стандартной трубки расположены на стандартизованный сетки (5 мм поле). Включить соответствующие координатные метки для выравнивания масок друг к другу во время изготовления и перетасовки отдельных устройств. Выложите Маска 2, Via Layer (задняя сторона), которая включает в себя только жидкостных порты. Включить координатных меток для выравнивания, чтобы маска 1. Рисунок 1. Acoustofluidic устройств. Схема эскизы архитектуры acoustophoretic устройства. (А) Вид сверху, показано общую конфигурацию H-фильтра (не в масштабе). (Б) Схема поперечного сечения канала в месте, отмеченного черным пунктирная линия в пункте (а), показывающий поле давления (синий пунктирные линии), и чувство акустических первичных сил излучения (PRF), которые управляют частиц к узловые плоскости (красные стрелки). Поперечное сечение канала900 × 200 мкм со стеной приблизительно 10 мкм, разделяющей основной (300 мкм) и широкой обводных каналов. (С) 3D представление разделения частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 2. чистых помещений Изготовление микрофлюидных чипы для Acoustophoresis Шаблон задней стороны порты жидкость, используя маску 2 на двойной стороне полированный 0,5 мм толщиной, 100-мм диаметр <100> кремниевой пластины с помощью стандартного положительно противостоять фотолитографии. Etch этот геометрии глубокой реактивного ионного травления (DRIE) на глубину 350-400 мкм. Включите пластины над и геометрии канала шаблон передней стороне жидкости с помощью маски 1 по стандартным положительно противостоять фотолитографии на другой стороне кремния. Затем установите пластину устройства на второй (пустой) кремния пластины несущей с помощью фоторезиста. Протравить каналов, также DRIE, на глубину 200 мкм, через травления кремния в местах порта (пластина несущей защищает поверхность инструмента DRIE). Де-крепление пластины устройства от пустой кремниевой пластины путем замачивания в устоять зачистки решение. Очистить пластины устройства и невыразительную 0,5 мм толщиной из боросиликатного стекла пластины с использованием раствора серной Piranha (кислоту и перекись водорода в соотношении 3: 1). Печать проточных каналов по анодно склеивания стекла и кремниевых пластин с использованием следующих параметров: давления в камере при 3 мторр, давление поршня на 1000 N, температура в 350 ° C, и не применять 750 V до ток падает ниже 0,2 мА. Разрежьте отдельные чипы, кроме с алмазным лезвием для резки на чипы на пиле. 3. Окончательный Устройство Ассамблея Приложение пьезоэлектрический преобразователь Примечание: Ультразвук генерируется в микрожидкостных чипа пьезокерамического преобразователя в прикрепленной к стороне кремния. От вWO-компонента с низкой вязкостью эпоксидной комплект, взвесить рекомендуемое соотношение обоих компонентов и смешать их полностью. Разлить смесь эпоксидной с пипеткой и равномерно через цирконат-титанат свинца (ЦТС) пьезокерамики создать тонкий слой, даже (примерно 10 мкл смеси эпоксидной для пьезоэлектрического с размерами 37,5 × 10 × 0,5 мм). С помощью подходящего джигу или приспособление, совместите эпоксидной сторону пьезокерамики с микрожидкостных чипа, обеспечивая нависающий участок на одной стороне для последующего присоединения проводов (рис 2а), и принести двух компонентов в контакт. Зажмите узел в тисках, заботясь, чтобы не треснуть любого из компонентов, и вылечить при температуре и продолжительности рекомендованной эпоксидной производителем. После эпоксидной вылечил, приложите тонкую проволока приводит к каждой стороне пьезокерамики, пайкой с тонкой наконечником паяльника, делая как можно более короткое контакт с пьезо, чтобы избежать тhermally де-поляризационный его. В качестве альтернативы, используйте проводящий клей для склеивания провода к пьезо. Рисунок 2. Жидкостная Макет, Чип Монтаж и Всемирный к Chip Интерфейс. Фото (с) акустической микрожидкостных чипа (внешние размеры 70 × 9 × 1 мм) с прикрепленными проволочных выводов пьезоэлектрический преобразователь, показывая три прохода разделения канал вниз чипа, (б) обычай струйные винтовые фитинги и обработанные компоненты трубки для интерфейса чип-на-мире, (C) чип, установленный на нижней стороне текучей плате с использованием зажимные приспособления, охватывая отверстие в плате, чтобы вентилятор охлаждения, (d) вид сверху плате с прикрепленными соединений труб и охлаждающего вентилятора, и (е) в разрезе схема винтов арматуры что интерфейс Tubiнг с установленными микрожидкостных чипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Устройство Монтаж и мира до стружки Interfacing Прикрепите чип на плате »текучей" (пластинка с сеткой регулярно интервал резьбой через отверстия), используя зажимные приспособления. Прикрепите охлаждающий вентилятор к плате регулировать температуру во время акустических экспериментов (см рисунок 2). ПРИМЕЧАНИЕ: Работа без охлаждающего вентилятора при типичных напряжениях привода повышает температуру устройства для 70-80 ° С. Это значительно сдвигает резонансную частоту из-за измененного скорости звука в жидкости, и может негативно повлиять на жизнеспособность любых биологических частиц, которые были обработаны. Винт в чип-в-мире разъемов, описано ранее в другом месте 22 и показано на рисунке 2. Регистрация Их яnterface трубки к дополнительной трубки на входах и выходах, использующие стандарт ¼ "-28 союзы для 1/16" трубки. 4. Характеристика акустической характеристики фокусировки ПРИМЕЧАНИЕ: Системные компоненты, необходимые для акустической фокусировки характеристики группируются в список материалов. Шаги 4.1 и 4.2 ниже, применяются к любому Основной Устройства, используемого с этой платформой, в то время как последующие шаги описывают операции, характерные для acoustofluidic устройства обсуждаемой здесь. Конфигурация системы Соберите микрожидкостных чип, используя всемирно к микросхеме соединений на плате жидкостной, как описано в разделе 3. Убедитесь соединений с помощью трубок (например, 1/16 "диаметр труб наружный Фторполимер) в жидкости насоса и сбора флаконов. Установите плате сборки на этапе микроскопа, способного флуоресценции изображений, оснащенного ПЗС-камеры. Подключите длины малого внутреннего diameteг (ID) трубки (0,006 "рекомендуется) сразу после чипа (см рис 4) в качестве ограничителей потока, которые стабилизируют систему и контроля расщепление потока между выходами микросхем. Используйте большие трубы ID, такие как 0,01 или 0,03 "", для всех других соединений. Оцените гидродинамического сопротивления потока R H каждой части трубки с длиной L и диаметром D внутренней используя уравнение R H = 128 мкл / πD 4, где μ является динамическая вязкость жидкости в. Перепад давления Δ Р-за каждой длины труб под данной скорости потока Q задается Δ P = QR ч. Выберите соотношение длин ограничителя, чтобы разделить поток между выходами, которые необходимы для разделения метод используется. Оптимальное разделение с акустическими чипов в этом протоколе требует SPO: соотношение ПОЛ потока приближенииДЕТАЛЬ 65: 35%. Выбрать длину ограничителей потока на выходе, так что их сопротивление текучей крайней мере в 3-4 раза больше, чем общее сопротивление в остальной части системы (соответственно подведены последовательно или параллельно). Для acoustophoresis устройства, используемого в данной работе, длины шлангов 35 и 65 см для ПОЛ и SPO подходят. ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание должно быть уделено R ч любого микрожидкостных Основной устройства. Для нашей акустической фокусировки чип в этой работе, R H является низким из-за его относительно большие размеры канала, так что подключенные сопротивления трубки легко превысить его. Для устройств с меньшими размерами каналов, сопротивление чипа может преобладать в трубки системы, в этом случае дизайн и контроль на чипе канала R ч является дополнительным фактором в шаге 1 этого протокола. Подробные принципы и руководящие дизайн доступны в литературе. 23,24 Проверка системы Проверьте утечки, чтобы убедиться, что устройство Микрожидкостных не имеет дефектов, и все соединения труб уплотнены. Разливают воду через впускные трубы по мере необходимости с помощью шприца и контролировать любой жидкости протекать в основном канале. Не включать известный объем через чип, и измеряют объемы собранных из точек, чтобы обеспечить, что отношение потока, как ожидалось. Отклонения от ожидаемого объемном соотношении может указывать завалов в одной из торговых точек или утечки соединений. Для поддержания чистоты и предотвращения системного засорения флеш всю систему (жидкостный труб и чип) с соответствующими чистящими растворами (например, отбеливатель, этанол, вода) до и после выполнения каких-либо экспериментов. В случае сабо или завалов в одной из торговых точек, промойте систему в то время как подключить четкое выход, чтобы очистить блокировку. Если это не удается, изменить направление потока при промывке,возможно, нанесение быстрые импульсы обратного потока (используя вручную приводом шприца). Наконец, если засорение до сих пор не могут быть удалены, следует заменить или чип, при необходимости. Частота сканирования Настройка для акустической фокусировки Заполните обводной канал (рисунок 1) с жидкостью, например деионизированной воды, этанол или фосфатным буферным раствором (PBS) путем ручного введения с помощью шприца. Обратите внимание, что эта жидкость не вступает в контакт с образцом обрабатывается. Детали регулировки положения узла с использованием различных жидкостей обходные описаны в другом месте 16,17. Вкратце, если узел должен быть ближе к разделительной стенкой, использовать меньше плотности жидкости перепускной, таком как этанол; для размещения узла ближе к образца входного потока, выбрать более плотную жидкость, такую ​​как раствора глицерина. Сделать шарик раствор приблизительно 0,01% (вес / объем) 5-8 мкм флуоресцентные полимерные гранулы суспендировали в буфере PBS, таких как с0,05% твин-20 и заполнить образец входной шприц с раствором борта. Заполните впускной буфера шприц с тем же самым буфером (это не нужно быть таким же, как и в жидкости обводного канала). Отметим, что в целом, буфер выбран в соответствии с приложением (см Шаг 5.1). С текучей плате на столике микроскопа, фокус примерно на полпути в глубину канала в прямой области канала непосредственно перед выходом с в обоих каналах (разделение и байпас) в поле зрения. Дополнительный косой угол внешним источником света может потребоваться, чтобы стенки каналов видно, для успешного постобработки данных изображения. Автоматизированная Частота сканирования и захвата изображения Сделайте электрические соединения, используя экранированные кабели (например, RG-58, оснащенные разъемами BNC) к функции генератора с частотой (ВЧ) усилитель доставить сигнал возбуждения в преобразователь пьезо. При желании, подключить осциллограф квыход функционального генератора для контроля фактического напряжения, подаваемого на преобразователь. Включите охлаждающего вентилятора, и установить генератор функций, таких, что выход на радиочастотный усилитель к преобразователю пьезо в диапазоне 12-25 вольт пик-пик (п-п). Установите оба шприцы той же скорости потока между 50 и 200 мкл / мин. Использование одного шприцевой насос для привода обоих шприцев с тем же двигателем рекомендуется, чтобы минимизировать возмущения в поток. Выполните процедуру сканирования частоты, указав начальную и конечную частоты, размер шага между частотными значениями, а пьезоприводу напряжения с помощью автоматизации инструментарий лаборатории, такие как National Instruments LabVIEW. На каждом шаге частоты, применить напряжение в течение 15 секунд, чтобы позволить системе, чтобы уравновесить, то захват 10 изображений бус, проходящих через чип для последующего анализа (время экспозиции от 10 до 100 мс, рекомендуется). Между еACH применяется частотный шаг, выключите напряжение примерно 20 сек, чтобы шарики распространять равномерно по каналу и удалить уклон в сосредоточении от ранее применяемого шага частоты. Анализ изображений для определения резонансной частоты и положение фокусировки Запустите сценарий анализа изображений (например, сценарий AF_freqScanPlotter.m MATLAB, поставленного с данным протокола) и введите необходимую информацию в подсказок: выберите список файлов изображений, генерируемых в шаге 4.4, введите Начать сканирование и остановить частоты и размер шага, полная ширина канала, расположение стены, и, наконец, выберите регион на изображение, чтобы проанализировать, в том числе как разделение и обводных каналов. Соблюдайте средней сценарий анализа набор изображений, снятых на каждом шаге частоты, и средние значения интенсивности вдоль направления потока. Это приводит к поперечной линии сканирования интенсивности флуоресценции. ПРИМЕЧАНИЕ: частота, соответствующая ВЫСО ул интенсивность определяется как резонансной частоты (рис 3, средний ряд), и положением в канале, где самая высокая интенсивность происходит это положение фокусировки (фиг.3, нижний ряд). Рисунок 3. Представитель сканирование частот. Пример данных частоты развертки для хорошо сочетании (А) и слабо связанной (B) и пьезо чипа. Верхний ряд: интенсивность флуоресценции из бисера (красный представляет высокий, и синий представляет низкой интенсивности). Средний ряд: максимальная интенсивность на каждой частоте. Нижний ряд: расположение максимальной интенсивностью, где красная пунктирная линия указывает прогнозируемого фокусировки позицию, и красные алмазы показывают резонансную частоту, как определяется максимальной интенсивности.г "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 5. Автоматизированная Разделение ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированная эксперимент разделения запустить, чтобы отделить крупные частицы от мелких частиц из-за размера зависит от акустических фокусировки сил, приложенных в микрожидкостных чипа. Необходимые компоненты системы объединены в список материалов. Конфигурация системы и подготовки проб Подключите микрожидкостных чип в шприцевой насос, мульти-порт с компьютерным управлением отбора клапаны, ПК-интерфейсом расходомеры, и трубки, как показано на рисунке 4. Эта конфигурация позволяет автоматизировать обработку образцов через микрожидкостных чип разделения, а также автоматизированное очистки шаги между экспериментами, чтобы удалить перекрестное загрязнение и образец унос. Использование буфера выборок, пригодных для клеток или частиц должны быть разделены, или в соответствии с требованиями к пробирного анализаиспользоваться после разделения. Как и на шаге 4.3.2, буфер восстановления (но не обязательно байпас жидкости) должно совпадать с образца текучей среды. Примечание: Любые водные буферы, обычно используемые в биологических образцах (например, PBS) имеют акустические свойства, подобные воде и не будет заметно изменить характеристики акустического устройства. Использование образцов жидкостей с плотностью и вязкостью, значительно отличающейся от воды можно, но рекомендуется только для операторов с большим опытом acoustophoresis. Рисунок 4. Конфигурация системы Акустическая для автоматизированных экспериментов по выделению. Синие линии проследить путь главного потока через систему. Все зеленые и черные линии 0,03 "Внутренний диаметр (ID) трубы, и все синие и серые цвета линии 0.01" ID трубки с еxception холдинга катушек, которые 0.03 "ID, и ограничители расхода, которые 0,006" ID. Шприцы заполнены буфера и холдинговые катушки имеют достаточный объем (550 мкл), чтобы предотвратить поглощение каких-либо образцов или реагентов для очистки в шприцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Порядок разделения Состояние предварительного запуска. Перед запуском разделение, гарантировать, что очистка реагентов резервуары (отбеливатель, этанол, буфер) имеют достаточную жидкость, резервуары для отходов, не полностью, а жидкость линии грунтовкой (т.е., наполненный раствором). Если последнее условие является неопределенным, или если система в настоящее время работают в первый раз после холостого хода (например, в первый раз в определенный день), запустить автоматическую процедуру очистки (см Шаг 5.3 ниже). Установите клапаны 3 и 4 на выходах микросхем течь тратить ResErvoirs первоначально. Включите вентилятор охлаждения, и установите функцию генератора на резонансной частоте для акустической чип используется, как определено на этапе 4.5. Отрегулируйте уставки напряжения на генераторе функции, так что усилитель РФ выходы между 12 и 25 V PP, как подходит для требуемого разделения. Подключите входная выборка флакон, флакон входной буфер, и соответствующие флаконы сбора к системе. Просто перед установкой образца входных флакон его пикап трубки, вихревые флакон кратко повторно приостанавливать любые частицы, которые могут быть урегулированы. Затем прикрепите флакон и инициировать процедуру разделения без промедления. ВНИМАНИЕ: Если образец для обработки содержит потенциально инфекционные агенты, флаконы должны быть такого типа, с завинчивающейся крышкой, чтобы сохранить герметичную систему и предотвратить образец аэрозолизацию. Кроме того, при работе с биологически опасными материалами, обрабатывать все флаконы и трубки при ношении необходимую защитную экипировку и с помощью REQuired управления опасности и процедуры для Группы биологического риска и уровня биобезопасности в зависимости от материала. Обратитесь институциональной политики и протоколов в случае любой неопределенности. Использование программы в лабораторной автоматизации инструментария для управления клапанами, датчиками расхода и насоса осуществлять полностью автоматическую процедуру разделения. ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура переключает клапаны, приводит шприцевой насос снятие и настой, и мониторы расходомер данные для правильного ГРМ сбор пример вывода фракций. Основные шаги приведены ниже в 5.2.4.1 5.2.4.3 через, как если бы выполняться вручную. Премьер-пикап трубки. Вывод примерно 15 мкл из пробы ввода флакона, чтобы полностью заполнить трубу, соединяющую его с Valve 1. Одновременно, премьер-трубка подключения входной буфер флакон клапан 2. Аналогичным образом, премьер впускной воздушный клапан 1 для того, чтобы это не содержит жидкости. Наконец, перейдем Клапаны 1 и 2, чтобы изгнать тратитьИзбыток жидкости или воздуха, который вошел в катушку загрузки. Загрузить образец катушки, как показано на фиг.5а. Типичная последовательность загрузки для обработки 250-мкл образец вывести 25 мкл воздуха при 50 мкл / мин, затем 250 мкл образца при 200 мкл / мин, с последующими 35 мкл ведущего буфера при 200 мкл / мин и, наконец, еще 25 мкл воздуха при 50 мкл / мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы и скорости потока по выбору пользователя. Следует отметить, что эта нагрузка последовательность в обратном порядке, как жидкость заглушки будет течь через устройство для разделения. Начните вливание образца. Установить шприцевые насосы влить загруженные пробки жидкости с желаемой скоростью (обычно 100 мкл / мин). Монитор скорости потока на SPO и ПОЛ с расходомерами, чтобы обеспечить поток устойчив и при соотношении, определенном на шаге 4.1, и что засорение не произошло. Соберите разделенных фракций. Когда датчики расхода обнаружить всплеск расхода, с указанием годовыхSsage первого воздушного зазора, включите соответствующий выходной клапан от отходов (где он в шаге 5.2.1) в пробирку для сбора образца. После прохождения образца от чипа, наблюдать Расходомер обнаружить второй воздушный зазор. На данный момент, переключиться выходные клапаны обратно в отходы. После полный объем загружен с шага 5.2.4.2 разливают, остановить вливание шприцевой насос, и прекращает процедуру автоматизации, когда скорость потока достигает нуля. После окончания эксперимента разделение завершится, отсоедините SPO и примеры ПОЛ сбора флаконов и хранить их надлежащим образом для последующего анализа. Автоматизированная Очистка и обеззараживание ПРИМЕЧАНИЕ: Перед обработкой каждого образца, флеш и обеззараживания весь жидкостный систему, используя следующую процедуру автоматизированной. Закрепите SPO и ПОЛ коллекция флаконов трубы, а также образец пикап трубку в пустые флаконы для сбора избыточного чистящие что будут сброшены throuGH трубы. Начните процедуры автоматической очистки системы. Как и в автоматизированной процедуры разделения на шаге 5.2, программа должна управлять клапанами и шприцевой насос, чтобы последовательно загрузить удерживающую катушку с очистки реагентов и промывки их через систему. Выполните следующую процедуру очистки: на одном уровне с 10% хлорной, затем 70% -ным этанолом, и в конечном водой или соответствующим буфером физиологическим раствором (например, 1x PBS или буфер, используемый для обработки образцов). Используйте следующие объемы: флеш 450 мкл для отбеливателя и этанола, и 1000 мкл для воды / буфера. Во время промывки шагов, промыть каждого реагента в то время как SPO выпускной клапан ПОЛ установлен в порту, который блокируется, а затем наоборот, чтобы удалить любые потенциальные засорения в ограничители потока на выходе. Поддержание отмены и настой потока темпы 300-500 мкл / мин, чтобы минимизировать образование пузырьков в насосно-компрессорных труб и противодавления накопления, когда либо СПО или ПОЛ заблокирован. Discaий лишние промывке решения и флаконы, в которых они, собранные после проведения соответствующих процедур для обработки биологического или химического отходов.