Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice

1. Acoustophoretic Device Design en fotomasker Layout OPMERKING: Algemene overwegingen en begeleiding voor microfabricage procesontwerp en masker lay-out kan worden gevonden in teksten over microfabricage en tutorials van fotomasker ontwerp 19-21. Indeling Mask 1, de Fluidic Layer (voorkant), met behulp van geschikte CAD-software. Kies een geometrie die monsterinjectie en scheiding die geschikt is voor de gewenste toepassing toelaat. Voor akoestische scherpstellen, stelt u de vloeibare kanaalbreedte w om een resonantiefrequentie f n bieden groter dan 1 MHz volgens de vergelijking f n = nc / 2w, waarbij c de geluidssnelheid in de desbetreffende vloeistof en n het aantal staande golf knooppunten (bijvoorbeeld voor een 900-um breed kanaal, de twee- knooppunt resonantie wordt verwacht op f 2 = 1,65 MHz). OPMERKING: Particles bezetten verschillende laterale posities aan het einde van de scheiding kanaal moet verlaten verschillende verkooppunten. In dit protocol worden deeltjes op grootte gescheiden, zodat de uitlaten zijn aangeduid SPO LPO, van kleine deeltjes en grote deeltjes outlet, respectievelijk, zoals getoond in figuur 1. Stel het vloeistofkanaal lengte regelen hoe lang deeltjes worden blootgesteld aan het veld scheiding bij een bepaalde stroomsnelheid. Langere on-chip verblijftijd voor deeltjes te migreren als gevolg van de scheiding krachten moeten worden afgewogen tegen de grotere vereiste chip voetafdruk. LET OP: In onze akoestische gericht apparaten, de stroom kanaal maakt drie passen beneden de chip voor verhoogde verblijftijd (Figuur 2a). Bij een typische totale stroomsnelheid van 200 pl / min, deeltjes die door de 300 x 200 urn doorsnede, 117 mm lang scheidingskanaal besteden gemiddeld 2,1 seconde op het akoestische veld. Omvatten vloeibare havens in het masker Layout voor verbindingen met standaard slangen aangebracht op een gestandaardiseerde rooster (5-mm pitch). Omvatten geschikte vaste merktekens voor uitlijning van maskers met elkaar tijdens de fabricage en in blokjes snijden van de afzonderlijke apparaten. Indeling Mask 2, de Via Layer (achterzijde), die alleen bestaat uit vloeibare poorten. Omvatten vaste merktekens voor aanpassing aan Mask 1. Figuur 1. Acoustofluidic Device. Schematische schetsen van acoustophoretic apparaat architectuur. (A) bovenaanzicht, waarin de totale configuratie H-filter (niet op schaal). (B) Schematische voorstelling van het kanaal dwarsdoorsnede op de plaats gekenmerkt door de zwarte stippellijn in (a), die het veld druk (blauwe gestippelde lijnen), en het gevoel van de akoestische primaire straling krachten (PRF) dat deeltjes rijden in de richting knoopvlakken (rode pijlen). Het kanaal doorsnedeis 900 × 200 micrometer met een muur van ongeveer 10 micrometer dik het scheiden van de belangrijkste (300 micrometer breed) en bypass-kanalen. (C) 3D-weergave van de deeltjesfysica scheiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Cleanroom Fabricage van microfluïdische chips voor Acoustophoresis Patroon van de back-side vloeistofpoorten behulp Mask 2 op een dubbel-side 0,5 mm dik, met een diameter van 100 mm <100> silicium wafer gepolijst door standaard positief weerstaan ​​fotolithografie. Etch deze geometrie diepe reactief ionen etsen (DRIE) tot een diepte van 350-400 urn. Draai de wafer over, en het patroon van de front-side vloeistofkanaal geometrie met behulp Mask 1 door standaard positieve resist fotolithografie op de andere kant van het silicium. Vervolgens monteer het apparaat wafer om een ​​tweede (lege silicium) carrier wafer met fotolak. Etsen kanalen, ook met DRIE, tot een diepte van 200 pm, doorgaande etsen van het silicium in de haven locaties (de drager beschermt de wafer DRIE gereedschap oppervlak). De-mount het apparaat wafer van de lege Si wafer door het weken in weerstaan-stripoplossing. Reinig het inrichtingsplak en eentonig 0,5 mm dik borosilicaatglas wafer via Piranha-oplossing (zwavelzuur en waterstofperoxide in een 3: 1 verhouding). Verzegel de vloeistofkanalen door anodisch binden van het glas en silicium wafers met de volgende parameters: kamerdruk bij 3 mTorr, de zuiger druk op 1000 N, temperatuur 350 ° C en toepassen 750 V totdat de stroom minder dan 0,2 mA. Snijd de individuele chips uit elkaar met een diamant mes op een dicing zaag. 3. Definitieve inrichtingsamenstel Pezouitstraler Attachment OPMERKING: Ultrasound wordt gegenereerd in de microfluïdische chip met een piezoceramic transducer die aan het siliciumatoom kant. Uit bijwo-component lage viscositeit epoxy kit, wegen uit de aanbevolen verhouding van beide componenten en meng ze grondig. Verdeel de epoxy mengsel met een pipet en gelijkmatig verdeeld over een loodzirconaattitanaat (PZT) piëzokeramisch een dunne, egale laag (ongeveer 10 pl epoxymengsel een piezo met afmetingen van 37,5 x 10 x 0,5 mm) te maken. Met behulp van een geschikte mal of fitting, lijn de epoxy van het piëzokeramische de microfluïdische chip, waardoor een overhangende gebied aan de ene kant voor latere bevestiging draad (zie figuur 2a), en de twee componenten in contact te brengen. Klem de assemblage in een bankschroef, zorg ervoor dat u een van de componenten te kraken, en genezing bij de temperatuur en de duur aanbevolen door de epoxy fabrikant. Nadat de epoxy is uitgehard, hechten fijne gauge aders aan elke zijde van de piëzokeramische door solderen met een fijne punt soldeerbout, waardoor de kortst mogelijke contact met de piëzo om t voorkomenhermally de-polariserende het. U kunt ook gebruik maken van een geleidende lijm om draden lijm aan de piëzo. Figuur 2. Fluidic Breadboard, Chip Montage, en World-to-Chip Interface. Foto's van (a) de akoestische microfluïdische chip (uitwendige afmetingen van 70 × 9 × 1 mm) met aangebouwde piëzo transducer draad leads, met drie doorgangen van de scheiding kanaal langs de chip, (b) aangepaste fluïdische schroefverbindingen en bewerkte buizen onderdelen voor de chip-to-wereld-interface, (c) de chip gemonteerd aan de onderzijde van de vloeibare broodplank met spaninrichtingen, verspreid over een opening in het breadboard te staan ventilator koeling, (d) een bovenaanzicht van de breadboard met aangehechte buisverbindingen en ventilator, en (e) een schematische dwarsdoorsnede van de schroefverbindingen de tubi communicerenng met gemonteerde microfluïdische chip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Apparaat Montage en World-To-Chip Interfacing Bevestig de chip naar de "vloeibare breadboard" (een plaat met een raster van regelmatige afstand staande threaded doorgaande gaten) met behulp spaninrichtingen. Bevestig een koelventilator de breadboard temperatuur gedurende akoestische experimenten reguleren (zie figuur 2). OPMERKING: Bediening zonder de koelventilator op typische rijden spanningen verhoogt het apparaat de temperatuur tot 70-80 ° C. Dit significant verschuift de resonantiefrequentie als gevolg van veranderde geluidssnelheid in de vloeistof, en kunnen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van elke biologische deeltjes die worden verwerkt. Schroef chip-to-wereld connectors eerder elders beschreven 22 en getoond in figuur 2. Doe deze interface buizen om extra buizen aan de in- en uitgangen met behulp van standaard ¼ "-28 vakbonden voor 1/16" slang. 4. Karakterisering van Acoustic scherpstelling LET OP: Systeem componenten die nodig zijn voor akoestische focussen karakterisering zijn gegroepeerd in de Materials List. Stappen 4.1 en 4.2 hieronder van toepassing op alle Core-apparaat gebruikt met dit platform, dat volgende stappen beschrijven handelingen die specifiek zijn voor de acoustofluidic apparaat hier besproken. Systeem configuratie Monteer de microfluïdische chip met behulp wereld naar chipverbindingen de vloeibare breadboard, zoals beschreven in sectie 3. De verbindingen maken gebruik van buizen (bijvoorbeeld 1/16 "buitendiameter fluorpolymeer buis) een vloeistofpomp en verzamelen flesjes. Monteer het breadboard samenstel op het podium van een microscoop die fluorescentiebeeldvorming uitgerust met een CCD camera. Sluit lengtes van kleine innerlijke diameter (ID) buis (0,006 "aanbevolen) onmiddellijk na de chip (zie figuur 4) fungeren als stroomrestrictoren, waardoor het systeem te stabiliseren en de stroom splitsing tussen de chip outlets. Met grotere ID buizen, zoals 0,01 "en 0,03" voor alle aansluitingen. Schat de hydrodynamische stromingsweerstand Rh elk buisstuk met een lengte L en de inwendige diameter D met de formule R h = 128 gl / πD 4, waarin μ het fluïdum dynamische viscositeit. Het drukverschil Δ P aan elk leidingstuk bij een gegeven debiet Q wordt gegeven door P = Δ QR h. Kies een verhouding van lengte restrictor om de stroom tussen de uitlaten splitsen afhankelijk van de scheidingswerkwijze worden toegepast. Optimale scheiding met de akoestische chips in dit protocol vereist een SPO: LPO stroom verhouding van approximately 65: 35%. Kies de lengte van de uitlaat stroomrestrictoren zodanig dat de fluïde resistentie ten minste 3-4 maal groter zijn dan de totale weerstand in de rest van het systeem (adequaat samengevat in serie of parallel). Voor de acoustophoresis apparaat dat wordt gebruikt in dit werk, slangen lengtes van 35 en 65 cm voor de LPO en SPO zijn geschikt. LET OP: Een zorgvuldige afweging moet worden besteed aan R h van elke microfluïdische Core Device. Voor onze akoestische concentreren chip in dit werk, R h is laag vanwege de relatief grote kanaal afmetingen, zodat de aangesloten slangen weerstanden gemakkelijk overtreffen. Voor apparaten met kleinere afmetingen kanaal, kan de weerstand van de chip van de rest van het systeem buis, waarbij het ​​ontwerp en de controle van de on-chip kanaal R h is een bijkomende overweging bij stap 1 van dit protocol domineren. Gedetailleerd ontwerp principes en richtlijnen zijn beschikbaar in de literatuur. 23,24 System Verification Controleer op lekkage te controleren of de microfluïdische apparaat heeft geen gebreken en alle slangaansluitingen worden afgesloten. Verdeel water door de inlaat buizen als nodig is met een spuit en te letten op elke vloeistof lekken in het hoofdkanaal. Verdeel een bekend volume door de chip, en meet de vanuit de uitlaten volumes opdat de stroming verhouding zoals verwacht. Afwijkingen van de verwachte volumeverhouding kunnen verstoppingen in een van de uitlaten of lekkende verbindingen geven. Om het systeem schoon te houden en te voorkomen dat verstopping flush het hele systeem (vloeibare buizen en chip) met geschikte reinigingsmiddelen (bijvoorbeeld bleekmiddel, ethanol, water) voor en na het uitvoeren van elke experimenten. In het geval van klompen of blokkades in een van de verkooppunten, spoel het systeem, terwijl de stekker van de duidelijke stopcontact om de blokkade te wissen. Als dit niet lukt, omkeren van de stroomrichting tijdens het spoelen,eventueel aanbrengen snelle pulsen van terugstroom (met een handmatig bediende spuit). Tenslotte, als de blokkering nog niet kan worden verwijderd, plaatst de slang of chip, indien nodig. Frequentie Scan Setup voor akoestische Scherpstellen Vul het omloopkanaal (zie figuur 1) met vloeistof zoals gedeïoniseerd water, ethanol, of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door handmatige injectie met een spuit. Merk op dat deze vloeistof niet in contact komt met het monster wordt verwerkt. De data van het aanpassen knooppuntpositie bypass met verschillende vloeistoffen worden elders beschreven 16,17. Kortom, wanneer de node moet dichter bij de scheidingswand zijn, gebruik een lagere dichtheid bypass fluïdum, zoals ethanol; voor knooppunt plaatsing dichter bij de ingang monsterstroom Kies een dichter medium, zoals een glycerol oplossing. Wordt kraal oplossing van ongeveer 0,01% (w / v) 5-8 micrometer fluorescerende polymeerpareltjes gesuspendeerd in een buffer, zoals PBS met0,05% Tween-20 en vul het monster inlaat spuit met de kraal oplossing. Vul de buffer inlaat spuit met dezelfde buffer (dit hoeft niet hetzelfde fluïdum als in de bypass-kanaal). Merk op dat in het algemeen wordt de buffer gekozen om de applicatie (zie stap 5,1) passen. Met vloeibare breadboard op de microscooptafel richten ongeveer halverwege de diepte van het kanaal in een rechte kanaalgebied vlak voor de uitlaat met beide kanalen (scheiding en bypass) in het gezichtsveld. Een extra schuine hoek externe lichtbron kan nodig zijn het kanaal muren zichtbaar, voor een succesvolle post-processing van de beeldgegevens te maken. Geautomatiseerde Frequency Scan en Fotolader Voeg elektrische verbindingen met afgeschermde kabels (bijvoorbeeld RG-58 voorzien van BNC-connectoren) een functiegenerator met radiofrequentie (RF) versterker het excitatiesignaal aan de piëzo transducer te leveren. Optioneel, sluit een oscilloscoop aande uitgang van de functiegenerator voor het bewaken van het werkelijke spanning op de transducer. Zet de koelventilator, en stel de functiegenerator zodanig dat de uitgang van de RF-versterker aan de piëzo transducer in het bereik van 12-25 volt piek-tot-piek (Vpp). Zet beide spuiten met dezelfde stroomsnelheid tussen 50 en 200 ul / min. Met behulp van een spuitpomp beide spuiten aandrijving met dezelfde motor wordt aanbevolen om verstoringen aan de stroming te minimaliseren. Voer een procedure frequentie scan onder vermelding van het begin en einde frequenties, de grootte stap tussen de frequentie waarden en piëzobekrachtiging spanning met behulp van een laboratorium automatisering toolkit zoals National Instruments LabVIEW. Bij elke frequentiestap, gelden de spanning voor 15 seconden om het systeem in evenwicht, dan vastleggen 10 afbeeldingen parels die door de chip voor verdere analyse (belichtingstijden tussen 10 en 100 msec wordt aanbevolen). Tussen each toegepast frequentie stap, zet de spanning voor ongeveer 20 seconden te laten de parels gelijkmatig te verdelen over het kanaal en verwijder bias in focus van de eerder toegepaste frequentie stap. Image Analysis om resonantiefrequentie en Focussen positie te bepalen Uitvoeren van een beeldanalyse script (zoals de AF_freqScanPlotter.m MATLAB script voorzien van dit protocol) en voer de vereiste informatie op de aanwijzingen: selecteer de lijst met afbeeldingsbestanden gegenereerd in stap 4.4, voert u de scan start en stop frequenties en stap grootte, de volledige kanaal breedte, de muur locatie, en ten slotte selecteert u de afbeelding gebied te analyseren, met inbegrip van zowel de scheiding en bypass-kanalen. Let op de analyse script gemiddelde van de reeks van beelden vastgelegd op elke frequentie stap, en het gemiddelde van de intensiteit waarden langs de stroomrichting. Dit resulteert in een doorsnede linescan fluorescentie-intensiteit. NB: De frequentie die overeenkomt met de highe st intensiteit wordt gedefinieerd als de resonantiefrequentie (figuur 3, middelste rij), en de positie in het kanaal waar de hoogste intensiteit optreedt is de focus positie (figuur 3, onderste rij). Figuur 3. Vertegenwoordiger Frequency Scan. Voorbeeld van een frequentie scan gegevens voor zowel gekoppeld (A) en slecht gekoppelde (B) piëzo en chip. Bovenste rij: fluorescerende intensiteit van kralen (rood staat hoog en blauw staat voor lage intensiteit). Middelste rij: maximale intensiteit bij elke frequentie. Onderste rij: locatie van de maximale intensiteit, waar de rode gestippelde lijn geeft voorspeld focus positie, en rode diamanten geven resonantiefrequentie zoals bepaald door de maximale intensiteit.g "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. 5. Geautomatiseerde Scheiding Opmerking: De geautomatiseerde scheiding experiment wordt uitgevoerd om grote deeltjes uit kleine deeltjes te scheiden vanwege de in het microfluïdische chip grootte-afhankelijke akoestische focus krachten. De benodigde onderdelen zijn gegroepeerd in de Materials List. System Configuration en Monstervoorbereiding Sluit de microfluïdische chip naar de spuitpomp, computergestuurde multi-poort stuurkleppen, PC-interface stroommeter, leidingen, zoals weergegeven in figuur 4. Deze configuratie maakt geautomatiseerde verwerking van monsters via microfluidic scheiding chip, maar ook geautomatiseerde schoonmaken stappen tussen experimenten om kruisbesmetting en sample overdracht verwijderen. Gebruik een monsterbuffer geschikt is voor de cellen of deeltjes te scheiden, of zoals vereist door de analyse assayworden gebruikt na scheiding. Zoals in stap 4.3.2, moet de recovery buffer (maar niet noodzakelijk de bypass fluïdum) het fluïdummonster passen. OPMERKING: waterige buffers typisch gebruikt met biologische monsters (bijvoorbeeld PBS) wat de akoestische eigenschappen vergelijkbaar met water en zal niet merkbaar verandert de werking van het akoestische inrichting. Het gebruik van vloeistofmonsters met een dichtheid en viscositeit significant verschillend van water mogelijk, maar alleen aanbevolen voor exploitanten met aanzienlijke acoustophoresis ervaring. Figuur 4. Acoustic System Configuration voor Automated Scheiding Experimenten. De blauwe lijnen op te sporen de hoofdstroom pad door het systeem. Alle groene en zwarte lijnen zijn 0,03 "binnendiameter (ID) slangen, en al blauw en grijs-gekleurde lijnen zijn 0.01" ID slang, met de eXception van het bedrijf spoelen, die 0,03 'ID, en de stroom begrenzers, die 0,006 "ID. De spuiten zijn gevuld met buffer, en het bedrijf spoelen voldoende volume (550 pl) om opname van eventuele monsters of reiniging reagentia in de spuiten te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Scheiding Procedure Pre-run staat. Voorafgaand aan het uitvoeren van de scheiding, ervoor te zorgen dat de schoonmaak reagentiareservoirs (bleekmiddel, ethanol, buffer) over voldoende vocht, het afval reservoirs zijn niet vol, en de vloeiende lijnen zijn gevuld (dat wil zeggen, gevuld met oplossing). Als de laatste voorwaarde is onzeker is, of wanneer het systeem wordt voor de eerste keer na stationair draaien (bijvoorbeeld de eerste keer op een bepaalde dag), voert een automatische reiniging (zie stap 5.3 hieronder). Kleppen set 3 en 4 op de chip verkooppunten te stromen naar Rese verspillenrvoirs aanvankelijk. Zet de koelventilator, en stel de functiegenerator de resonantiefrequentie van de akoestische chip wordt gebruikt, zoals bepaald in stap 4,5. Pas de spanning set punt op de functie generator zodat de RF-versterker uitgangen tussen de 12 en 25 V pp, afhankelijk van de gewenste scheiding. Sluit de Sample Input Vial, Buffer Input Vial, en passende collectie flesjes aan het systeem. Net voordat u de Sample Input Vial zijn pick-up buizen, vortex de flacon kort om opnieuw op te schorten alle deeltjes die mogelijk hebben gevestigd. Maak dan de flacon en de inleiding van de scheiding routine zonder vertraging. LET OP: Als het monster te verwerken bevat mogelijk besmettelijke stoffen, moet de flesjes van een schroef-top te zijn, om een ​​gesloten systeem te handhaven en te voorkomen dat het monster aërosolvorming. Bovendien, als het werken met biologisch gevaarlijke materialen, behandelen alle flesjes en slangen, terwijl het dragen van de vereiste beschermende uitrusting en het gebruik van de required gevaar controles en procedures voor de biologische Risk Group en Biosafety Level eigenen om het materiaal. Raadplegen institutionele beleid en protocollen in geval van onzekerheid. Gebruik van een programma in een laboratoriumautomatisering toolkit voor de ventielen, volumestroom sensoren en pomp het uitvoeren van de volautomatische scheiding routine. LET OP: De routine schakelt de kleppen, bedient spuit terugtrekken en infuuspomp en monitoren stroom sensor data voor het verzamelen van de output monster fracties juiste timing. De belangrijkste stappen zijn hieronder samengevat 5.2.4.1 tot 5.2.4.3, alsof handmatig. Prime de pick-up buis. Trek ongeveer 15 gl van het volgende in- Vial aan de buis te sluiten op Valve 1. Tegelijkertijd volledig vullen, vul de buis die de Input Buffer Vial Valve 2. Op soortgelijke wijze, vul de luchtinlaat van de klep 1 te zorgen dat het bevat geen vloeistof. Tenslotte schakelt Afsluiters 1 en 2 te verdrijven om eventuele verliezenovertollig vocht of lucht dat het laden spoel heeft ingevoerd. Laad het monster spoel, zoals getoond in figuur 5a. Een typische laad- sequentie voor het verwerken van een 250-ul monster wordt 25 gl lucht trekken op 50 pl / min, vervolgens 250 gl monster bij 200 pl / min, gevolgd door 35 pl leidende buffer bij 200 pl / min, en tenslotte een 25 pl lucht bij 50 ul / min. LET OP: Alle volumes en debieten zijn de gebruiker te selecteren. Merk op dat deze belasting sequentie in omgekeerde volgorde waarin de vloeistof pluggen door de scheidingsinrichting stroomt. Begin monster infusie. Stel de spuitpompen het geladen fluïdum pluggen dien met de gewenste snelheid (meestal 100 pl / min). Toezien op de debieten van de SPO en LPO met flow sensoren om ervoor te zorgen dat de stroom is stabiel en in de verhouding bepaald in stap 4.1, en dat verstopping niet heeft plaatsgevonden. Verzamel gescheiden fracties. Wanneer de stroom sensoren detecteren een piek in de stroomsnelheid, met vermelding van paSsage van de eerste luchtspleet, schakelt de betreffende uitgang ventiel uit afval (waar het begon in stap 5.2.1) om een ​​monster collectie flacon. Na passage van het monster van de chip, observeert de stroom sensor detecteert de tweede luchtspleet. Op dit punt, schakelt de output kleppen terug te verspillen. Na de volledige volume geladen vanaf stap 5.2.4.2 wordt afgegeven, stoppen met de spuit pomp infusie en de automatisering routine te beëindigen wanneer het debiet op nul. Na de scheiding experiment is voltooid, koppelt u de SPO LPO monstername flesjes en bewaar ze op de juiste wijze voor verdere analyse. Geautomatiseerde Reiniging en Ontsmetting LET OP: Voor de verwerking van elk monster, flush en ontsmetten het gehele vloeibare systeem met behulp van de volgende geautomatiseerde routine. Zet de SPO LPO collectie flesje buizen, evenals het monster pick-up buis in de lege flesjes om overtollig schoonmaakmiddelen die worden doorgespoeld throu verzamelengh de buizen. Start het automatische systeem reiniging routine. Net als bij de geautomatiseerde scheiding procedure in stap 5.2, het programma moeten de kleppen en injectiepomp controleren om achtereenvolgens laden van de houdspoel met het schoonmaken reagentia, en spoel ze door het systeem. Voer de volgende reiniging routine: gelijk met 10% bleekmiddel, daarna met 70% ethanol, en eindigen met water of een geschikte buffer zoutoplossing (bijvoorbeeld 1x PBS of buffer gebruikt voor monster verwerking). Gebruik de volgende flush volumes: 450 ul voor bleekmiddel en ethanol en 1000 ul water / buffer. Tijdens het spoelen stappen, spoelen elk reagens in de SPO, terwijl de LPO uitlaatklep is ingesteld op een poort die geblokkeerd is, dan vice versa, om eventuele verstoppingen in het stopcontact stroom restrictors verwijderen. Onderhouden terugtrekking en infusie debiet van 300-500 pl / min tot bubble generatie minimaliseren in de slang en de tegendruk opbouw wanneer ofwel de SPO of de LPO is geblokkeerd. Discard de overtollige spoelen oplossingen en de flesjes waarin ze verzameld door het volgen van de juiste procedures voor het omgaan met biologische of chemische afval.