マイクロ流体精密小容量サンプル処理のためのプラットフォームとアコースティックマイクロデバイスで区切り生物学的粒子サイズのためのその使用

1. Acoustophoreticデバイスの設計とフォトマスクレイアウト注：一般的な考慮事項と微細加工プロセス設計とマスクレイアウトのためのガイダンスは、フォトマスクの設計の微細化のテキストとチュートリアルで見つけることができます19から21に 。 適切なCADソフトウェアを使用して、マスク1、流体層（表側）をレイアウトします。所望の用途に適切な試料注入及び分離を可能にするジオメトリを選択してください。 集束音響については、N F個の共振周波数を提供するために、流体チャネル幅 W を設定します cは 、関連する流体中の音の速度であり、nは 900ミクロン幅の広いチャネル用の定在波ノード（ 例えば 、数ある式F N = NC / 2ワットによれば1 MHzの、2より大きいノード共振がF 2 = 1.65 MHz）で期待されています。 注：パーティクル分離チャネルの終わり近くに別個の横方向位置を占めるのは、異なるコンセントから終了する必要があります。このプロトコルでは、粒子は、サイズによって分離されるので、 図1に示すように出口は、それぞれ、小粒子と大粒子のための出口、SPOとLPOが指定されています。 時間の粒子の長さを制御するための流路長さを設定し、特定の流速で分離電界にさらされます。長い粒子が分離力による移行するためのオンチップ滞留時間が大きく必要なチップ実装面積に対してトレードオフされなければなりません。 注：私たちの音響中心にデバイスでは、流路が増加し、滞留時間（ 図2a）、チップ下に3つのパスになります。 200μL/分の典型的な総流量で、300×200μmの断面を、117 mmの長い分離チャネルを流れる粒子は、音響分野で平均2.1秒に費やします。 マスクlayo内の流体ポートを含めます標準化されたグリッド（5-mmピッチ）上に配置された標準的なチューブへの接続のためにユタ。個々のデバイスの製造及びダイシング時にお互いにマスクの位置合わせのための適切な基準マークを含めます。 マスク2、唯一の流体ポートを含むビア層（裏面）に、レイアウトします。 1をマスクするためにアライメント用の基準マークを含めます。 図1. Acoustofluidicデバイス。acoustophoreticデバイス・アーキテクチャの概略スケッチ。 （a）は上面図を、全体的なH-フィルタの構成を示す（正確な縮尺ではありません）。 （b）は黒でマーク位置でのチャネル断面の模式図は、圧力場を示し、（A）に破線（青の線を点線）、およびに向かって粒子を駆動音響次放射力（PRF）の意味節面（赤矢印）。チャネル断面10μm程度の厚さのメイン（300ミクロン幅）とバイパスチャネル分離壁と900×200μmです。 （c）の粒子分離の3D表現。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 Acoustophoresisのためのマイクロ流体チップの2クリーンルーム製作パターン両面にマスク2を使用してバック側の流体ポートは、標準的なポジティブレジスト、フォトリソグラフィ法により0.5mmの厚さ100 mmの直径<100>シリコンウエハを研磨します。 350〜400ミクロンの深さに深い反応性イオンエッチング（DRIE）によって、この形状をエッチングします。 ウェーハを裏返して、シリコンの他の側に標準ポジティブレジスト、フォトリソグラフィ法によりマスク​​1を用いたパターンのフロント側流体チャネルの形状。次に、フォトレジストを用いて第2の（空白シリコン）キャリアウエハにデバイスウェハをマウントします。 スルーエッチング（キャリアウエハは、DRIEツール表面を保護する）ポートの位置にシリコンを、200ミクロンの深さに、またDRIEにより、チャネルエッチ。レジスト剥離液を浸漬することにより、ブランクSiウエハからデバイスウェハをデマウント。 デバイスウエハとピラニア溶液（1：1の比で3硫酸と過酸化水素水）を用いて特徴のない厚さ0.5mmのホウケイ酸ガラスウェハをきれい。 3ミリトールでのチャンバ圧力、千Nにおけるピストンの圧力、350℃の温度、および0.2ミリアンペア以下の電流滴まで750 Vを適用します。陽極以下のパラメータを用いて、ガラスやシリコンウエハを接合することによって流体チャネルを密封。 ダイシングソーのダイヤモンドブレードで個々のチップを離れてカットします。 3.最終的なデバイス組立ピエゾトランスデューサアタッチメント注：超音波は、シリコン側に取り付けられた圧電トランスデューサによってマイクロ流体チップ内で生成されます。 時からWO-コンポーネント低粘度エポキシキット、両成分の推奨比率を秤量し、それらを徹底的に混ぜます。 ピペットを用いてエポキシ混合物を分注し、薄い、均一な層（37.5×10×0.5mmの寸法のピエゾ用エポキシ混合物の約10μl）を作成するために、チタン酸ジルコン酸鉛（PZT）圧電セラミックに均等に分散。 適当な治具を用いて、後続のワイヤー取付け（ 図2aを参照）のための1つの側に張り出した領域を提供する、マイクロ流体チップと圧電セラミックのエポキシ側を位置合わせし、接触させる二つの成分をもたらします。コンポーネントのいずれかをクラックし、エポキシメーカーが推奨する温度及び時間で硬化しないように注意しながら、バイスにアセンブリを固定します。 エポキシ樹脂が硬化した後、ワイヤはTを避けるために、ピエゾと最も短い可能な接触が、微細な先端のはんだごてで半田付けすることによって、圧電セラミックの各側に導くファインゲージを取り付けますhermally脱分極を。また、ピエゾにワイヤを接着する導電性接着剤を使用しています。 図2.流体ブレッドボード、チップを取り付け、ワールド・ツー・チップ・インターフェース。（a）は、音響マイクロ流体チップの写真添付ピエゾトランスデューサリード線付き（70×9×1mmの外寸）、分離の3つのパスを示しますチップダウンチャネル、（b）は 、カスタム流体ねじ継手とチップ・ツー・世界インタフェースのための機械加工チューブ部品、（c）のチップができるようにブレッドボードの開口部にまたがる、クランプ治具を用いて、流体ブレッドボードの下側に取り付けられましたtubiのインターフェースファン冷却、（d）に取り付けられたチューブ接続と冷却ファンとのブレッドボードの平面図、及び（e）のねじ継手の断面模式取り付けられたマイクロ流体チップとngの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 デバイスのマウントと世界・ツー・チップのインタフェース 「流体ブレッドボード」クランプ治具を使用して（スルーホールスレッドの定期的な間隔のグリッドとプレート）にチップを取り付けます。音響実験中の温度を調節するためのブレッドボードに冷却ファンを取り付けます（ 図2を参照）。 注：一般的な駆動電圧で冷却ファンなしで動作させると、70〜80℃にデバイスの温度を上昇させます。これは、大幅に変更された流体中の音速に起因する共振周波数をシフトし、負処理されている任意の生物学的粒子の生存能力に影響を与える可能性があります。 以前に22の他の場所に記載し、 図2に示すように、チップ・ツー・世界のコネクタにねじ込みます。これらのIに参加標準を使用して、入口と出口で、追加のチューブにnterface管¼ "-28 1/16のための労働組合"チューブ。 アコースティックフォーカス性能の4キャラクタリゼーション注：音響焦点特徴付けのために必要なシステムコンポーネントは、物質一覧にまとめられています。 4.1ステップ以降は、ここで説明acoustofluidicデバイスに特定の動作を説明するのに対し、4.2以下、このプラットフォームで使用されるすべてのコアデバイスに適用されます。 システム構成第3節で説明したように、流体ブレッドボード上の世界・ツー・チップ接続を使用してマイクロ流体チップを組み立て流体ポンプおよび回収バイアルに（例えば1/16「外径フルオロポリマーチューブなど）のチューブを使用して接続してください。 CCDカメラを装備した蛍光イメージングが可能な顕微鏡のステージ上ブレッドボードアセンブリを取り付けます。 小さなインナーdiameteの長さを接続しますR（ID）のチューブすぐにシステムを安定させ、チップアウトレット間の分流を制御する流量制限として機能するチップ（ 図 4参照）の後（0.006」が推奨されます）。他のすべての接続のために、このような0.01 "0.03"のような大きなIDチューブを使用します。 μは流体の動粘度であり、長さL及び式R Hを用いて内径D = 128μL/πD4とチューブの各部分の流体力学的な流れ抵抗R Hを推定します。与えられた流量Qでチューブの各長さに圧力降下Δ はΔP P = QR hで与えられます。 使用されている分離方法のための適切なコンセントの間の流れを分割するために、リストリクタの長さの比を選択してください。このプロトコルにおける音響チップを搭載した最適な分離は、SPOを必要とします：approximaのLPO流量比をtely 65：35％。 出口流量制限器の長さを選択するように、それらの流体抵抗は、システム（適切に直列または並列に加算）の残りの部分における全抵抗よりも少なくとも3~4倍大きいです。この作品で使用されるacoustophoresisデバイスの場合、LPOとSPOのための35、65センチのチューブの長さが適しています。 注：慎重に検討は、任意のマイクロ流体コアデバイスの R hに与えられなければなりません。この作品で私たちの音響中心にチップの場合、R hは、その比較的大きなチャネル寸法に低いため、接続されたチューブの抵抗は簡単にそれを超えています。小さ ​​いチャンネル寸法を有するデバイスの場合、チップの抵抗はシステムのチューブの残りの部分を支配することがあり、ケースと内蔵チャンネル R hの設計と制御は、このプロトコルのステップ1の間の追加の考慮事項です。詳細設計の原則と指針は、文献に利用可能です。23,24 システム検査マイクロ流体デバイスは何の欠陥がなく、すべての配管接続が密封されていることを確認するために、漏れがないか確認してください。シリンジを用いて、必要に応じて入口管を通して水を分配し、メインチャネル内の任意の流体漏れを監視します。 チップを通して既知量を分注して、流量比が予想されることを確実にするためにコンセントから収集したボリュームを測定します。予想される容積比からの偏差は、コンセントまたは漏れ接続のいずれかで閉塞を示すことができます。 システムの清浄度を維持し、前と任意の実験を実行した後、適切な洗浄液（例えば、漂白剤、エタノール、水）で、システム全体（流体チューブとチップ）フラッシュ目詰まり防止するために。 閉塞をクリアするには、clearコンセントを差し込むながら店のいずれかで目詰まりや閉塞が発生した場合、システムをフラッシュします。これが失敗した場合、フラッシング時に流れの方向を逆必要に応じて（手動で作動注射器を用いて）逆方向の流れの急速なパルスを印加します。まだ詰まりを除去できない場合は最後に、必要に応じてチューブまたはチップを、交換してください。 アコースティックフォーカシングのための周波数スキャンの設定シリンジで手動注入によって、このような脱イオン水、エタノール、またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）のような流体と（ 図1参照）は 、バイパス流路を満たします。この流体が処理されているサンプルと接触しないことに注意してください。別のバイパス流体を使用してノードの位置を調整するの詳細は他の場所に記載されている16,17。簡単に述べると、ノードは、隔壁に近いエタノールなど、低密度のバイパス流体を使用する必要がある場合。近い入力サンプルストリームにノードを配置するための、グリセロール溶液として、密度の高い流体を選択します。 （w / v）の5-8μmの蛍光ポリマービーズは、を含むPBSなどの緩衝液に懸濁し、約0.01％のビーズ溶液を作ります0.05％のTween-20およびビーズ溶液とサンプル注入口シリンジを充填します。 （これはバイパスチャネルと同じ流体である必要はありません）同じバッファを持つバッファ入口シリンジを埋めます。一般的に、バッファは（ステップ5.1参照）、アプリケーションに適合するように選択されることに注意してください。 顕微鏡ステージ上の流体ブレッドボードを使用すると、ちょうど視野内の両チャネル（分離およびバイパス）とコンセントの前にまっすぐなチャネル領域におけるチャネルの深さにほぼ中間焦点を当てます。追加の斜角外部光源は、画像データの成功した後の処理のために、チャネルの壁が見えるようにするために必要とされてもよいです。 自動化された周波数をスキャンし、イメージキャプチャピエゾトランスデューサに励起信号を提供するために無線周波数（RF）アンプのファンクションジェネレータに（ 例えば 、RG-58は、BNCコネクタを装備した）シールドケーブルを使用して電気的接続を行います。必要に応じて、オシロスコープを接続実際の電圧を監視するための関数発生器の出力は、変換器に適用されます。 冷却ファンをオンにし、圧電変換器にRF増幅器の出力は、ピーク・ツー・ピーク12-25ボルト（V ppの）の範囲内であるような関数発生器を設定します。 50〜200μL/分の間で同じ流量に両方の注射器を設定します。同一のモータの両方の注射器を駆動するために、単一のシリンジポンプを使用すると、流れに乱れを最小限にすることをお勧めします。 このようなナショナルインスツルメンツのLabVIEWなどの実験の自動化ツールキットを使用して、周波数値との間の段差の大きさ、ピエゾ駆動電圧を開始および終了周波数を指定することで、周波数スキャンの手順を実行します。 各周波数ステップにおいて、システムが平衡化し、（推奨される10から100ミリ秒の間の露光時間）10次の分析のためのチップを流れるビーズの画像をキャプチャできるように15秒間電圧を印加します。 EとACHは、ビーズがチャネルにわたって均一に再分配させ、以前に適用される周波数ステップの焦点でバイアスを除去するために、約20秒間の電圧をオフにし、周波数ステップを適用しました。 画像解析は、共振周波数と焦点位置を決定するために、 （例えば、このプロトコルで提供AF_freqScanPlotter.m MATLABスクリプトとして）画像解析のスクリプトを実行し、プロンプトで必要な情報を入力します。ステップ4.4で生成された画像ファイルのリストを選択し、スキャン開始を入力し、周波数とステップサイズを停止し、フルチャネル幅、壁の位置、および最終的には分離し、バイパスチャネルの両方を含む、分析するための画像領域を選択します。 解析スクリプトを観察し、各周波数ステップで撮像された画像の集合を平均化し、流れ方向に沿った強度値を平均化します。これは、蛍光強度の断面ラインスキャンにつながります。 注：higheに対応する周波数目の強度は、共振周波数（ 図3、中段）、および最大強度が合焦位置（ 図3、下列）が発生したチャネル内の位置として定義されます。 よく結合した（A）のための周波数スキャンデータや不十分結合された（B）ピエゾとチップの図3。代表周波数スキャン。例。一番上の行：ビーズの蛍光強度（赤高い表し、青色は低強度です）。中段：各周波数における最大強度。下段：赤い破線最大強度の位置は、予測される焦点位置を示し、最大強度によって決定されるように赤い菱形は共振周波数を示します。G "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 5.自動分離注：自動化された分離実験は、マイクロ流体チップに加わる力を集中サイズ依存音響による小さな粒子から大きな粒子を分離するために実行されます。必要なシステム構成要素は、材料リストに一緒にグループ化されます。 システム構成とサンプル調製 図4に示すように、この構成では、マイクロ流体分離チップを介してサンプルの自動処理を可能にし、コンピュータ制御のマルチポート選択バルブ、PC-インターフェース流量計、およびチューブ、シリンジポンプにマイクロ流体チップを接続するだけでなく、自動化されましたクロスコンタミネーションやサンプルのキャリーオーバーを除去するために、実験間のステップを清掃。 分離すべき細胞または粒子に適したサンプル緩衝液を使用し、または分析するアッセイで必要に応じて分離後に使用します。ステップ4.3.2のように、回復バッファー（必ずしも必要ではないが、バイパス流体）が試料流体と一致する必要があります。 注：典型的には、生物学的サンプル（例えば、PBS）で使用される任意の水性緩衝液は、水に似た音響特性を有し、かなり音響装置の性能を変更しません。水と著しく異なる密度と粘度の試料流体の使用が可能ですが、唯一の重要なacoustophoresisの経験を持つ事業者にお勧め。 自動分離実験のために、図4の音響システム構成。青い線は、システムを介してメイン流路をたどります。すべての緑と黒の線は0.03 "の内径（ID）のチューブ、すべての青と灰色の線は0.01であり、「ある電子と、IDチューブxception 0.03であり、保持コイル、「ID、および0.006であり流量制限、「IDの。注射器は、緩衝液で満たされ、保持コイルが注射器に任意のサンプルや洗浄試薬の取り込みを防止するのに十分な量（550μl）を持っている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 分離法前の実行状態。分離を実行する前に、洗浄試薬貯蔵（漂白剤、エタノール、バッファは）十分な流体があることを確認し、廃棄物の貯水池が完全ではなく、流体ラインをプライミングされている（ すなわち 、溶液で満たされました）。後者の条件は不明である、またはシステムがアイドリング後に初めて実行されている場合（例えば、特定の日の最初の時間）は、自動クリーニング手順を実行する場合（以下のステップ5.3を参照）。 RESEを無駄に流れるようにチップ店舗でバルブ3と4を設定します最初はrvoirs。 冷却ファンをオンにし、ステップ4.5で決定されるように、使用されている音響チップ用の共振周波数でファンクション・ジェネレータを設定します。関数発生器の電圧設定点を調整するように所望の分離に応じて12と25 V ppの間のRF増幅器出力します。 システムへのサンプル入力バイアル、バッファ入力バイアル、および適切な収集バイアルを接続します。ただ、そのピックアップチューブにサンプル入力のバイアルを取り付ける前に、渦バイアル簡単に定住している可能性のある粒子を再懸濁します。その後、バイアルを添付して、遅滞なく分離ルーチンを開始します。 注意：処理されるべきサンプルは、潜在的に感染性物質が含まれている場合は、バイアルを密閉系を維持し、サンプルのエアロゾル化を防ぐために、ネジトップ型でなければなりません。バイオハザード物質を扱うときに、必要な保護具を着用し、REQを使用しながら、また、すべてのバイアルとチューブを扱います生物学的リスクグループとバイオセーフティレベルのためuir​​ed危険統制および手続材料に適しています。不確実性の場合には、制度の方針およびプロトコルを参照してください。 、バルブを制御するセンサーを流れ、全自動分離ルーチンを実行するためにポンプするために実験室の自動化ツールキットでプログラムを使用してください。 注：ルーチンは、バルブを切り替え、シリンジポンプ離脱および注入を作動させると、モニタが正しく出力サンプル画分の収集のタイミングのためのセンサデータを流します。手動で行っているかのように主な手順は、5.2.4.3を通じて5.2.4.1で以下に要約されています。 プライムピックアップチューブ。同様の方法でバルブ2にバッファ入力バイアルを接続するチューブがいること、それを確実にするために、バルブ1の空気入口プライム、プライム、完全に同時にバルブ1に接続するチューブを埋めるためのサンプル入力バイアルから約15μLを撤回します全く流体を含んでいません。最後に、いずれかを無駄に排出するバルブ1と2を切り替えますロードコイルに入った余分な流体または空気。 図5aに示すように、サンプルコイルを読み込みます。 250μlのサンプルを処理するための典型的なロードシーケンスは、最終的に200μL/分でリーディングバッファー35μlのに続いて200μL/分でサンプルを250μl、その後、50μL/ minで空気の25μlのを撤回することであり、 50μL/ minで空気の別の25μlの。 注：すべてのボリュームと流量はユーザが選択可能です。このロードシーケンスは、流体プラグが分離装置を通って流れることになるかと逆の順序であることに注意してください。 サンプルの注入を開始します。所望のレート（通常は100μL/分）でロードされた流体プラグを注入するようにシリンジポンプを設定します。その流れを確保するための流量センサとSPOとLPOで流量を監視することは着実にステップ4.1で決定された比率であり、その目詰まりが発生していません。 分離された画分を収集します。流量センサは、流量のスパイクを検出した場合、PAを示します第1のエアギャップのssageは、サンプル収集バイアルに（これはステップ5.2.1で開始）廃棄物からの対応する出力弁を切り替えます。 チップからの試料が通過した後、流量センサは、第2のエアギャップを検出する観察。この時点で、無駄に戻って、出力バルブを切り替えます。ステップ5.2.4.2からロードされたフルボリュームが分配された後に、シリンジポンプの注入を停止し、流量がゼロになると、自動化ルーチンを終了します。 分離実験が完了した後、SPOとLPOサンプル収集バイアルを切断し、その後の分析のために適切に保管してください。 自動クリーニングと汚染除去注：各サンプル、フラッシュを処理する前に、次の自動化ルーチンを使用して全体の流体システムを除染。 throuフラッシュされ、過剰なクリーニングソリューションを収集するために、空のバイアルにSPOとLPO回収バイアル管と同様に、サンプルの撮像管を固定しますチューブをGH。 自動化システムのクリーニングルーチンを開始します。ステップ5.2で自動化された分離手順と同様に、プログラムは順次洗浄試薬と保持コイルをロードするためのバルブとシリンジポンプを制御する必要があり、システムを介してそれらをフラッシュします。 70％エタノールで、その後、10％の漂白剤でフラッシュし、水または適切な生理食塩水緩衝液で終わる（例えば、1×PBSまたはサンプル処理のために使用するバッファ）：以下のクリーニング・ルーチンを実行します。漂白剤やエタノール450μlを、水/緩衝1,000μL以下のフラッシュボリュームを使用してください。 LPOの出口弁がブロックされたポートに設定されている状態で、フラッシングステップの間に、出口流量制限内の任意の潜在的な詰まりを除去するために、またその逆その後、SPOに各試薬を洗い流します。 SPOまたはLPOのいずれかがブロックされたときに、チューブと背圧の蓄積に気泡の発生を最小限にするために300〜500μL/ minの撤退および注入流量を維持します。 Disca過剰フラッシングソリューション、それらが生物学的または化学的廃棄物を処理するための適切な手順を実行することで、収集されたバイアルをRD。