微流体平台精密小批量来样加工及它的使用尺寸分离生物颗粒的声微型

1. Acoustophoretic装置的设计和光掩膜布局注：一般考虑和微细加工工艺设计和版图设计指导，可以在微细加工光掩膜文本的设计和教程中找到19 – 21。 铺陈面膜1时，流体层（前侧），使用适当的CAD软件。选择的几何形状允许样品注射和分离适合于期望的应用。 声学聚焦，设定流体通道宽度 w是提供一种共振频率F N 根据公式F N = NC /2瓦特，其中c是声音在有关流体的速度，n是驻波节点 （如数量，对900微米宽的通道大于1 MHz时，双节点共振有望在 f 2 = 1.65兆赫）。 注：粒子Ş占据附近的分离通道的末端独特的横向位置应该退出从不同的网点。在这个协议中，颗粒是通过大小分离，所以出口被指定SPO和LPO，对于小颗粒和大颗粒出口，分别如图1。 设置流体通道长度，以控制时间颗粒的长度在一个特定流速暴露于分离场。长片上的停留时间，颗粒由于分离力迁移，必须权衡危害较大的所需芯片的足迹。 注意：在我们的声学聚焦装置，所述流路，使三道次走在芯片为增加停留时间（图2a）。以200微升/分钟，粒子流过300×200微米的横截面，117毫米长的分离通道的典型总流速平均花费2.1秒中的声场。 包括在掩模LAYO流体端口UT斯达康用于连接到设置在一个标准化电网（5毫米间距）标准管。包括制造和各个设备的切割过程中适合基准标记为掩模，以彼此的对准。 铺陈面膜2中，通过层（背面侧），其仅包括流体端口。包括基准标记对准掩盖1。 图1. Acoustofluidic设备。acoustophoretic装置结构示意图草图。 （ 一 ）顶视图，示出了整体的H-过滤器配置（不按比例）。 （b）该通道的横截面在标志是黑色的位置的原理图中虚线（a）中，示出了压力场（蓝色虚线），并且声初级辐射力（PRF）驱动颗粒朝向的感节面（红色箭头）。通道的横截面是900×200微米与壁大约10微米厚的分离主（300微米宽）和旁路通道。 （ 三）粒子分离的3D表示。 请点击此处查看该图的放大版本。 微流控芯片的Acoustophoresis 2.洁净室制作图案使用面膜2上的双面背面侧流体端口抛光0.5毫米厚，100毫米直径的<100>的硅晶片由标准正型抗蚀剂的光刻。蚀刻这种几何形状通过深反应离子蚀刻（DRIE）到350-400微米的深度。 转晶片上，并且使用掩模图案1的前侧流体通道的几何形状由标准正型抗蚀剂的光刻到硅的另一侧。然后，使用光致抗蚀剂贴装器件晶片到第二（空白硅）载体晶片。 蚀刻通道，也通过DRIE，到200μm的深度，通过蚀刻在所述端口位置（载体晶片保护DRIE工具表面）硅。通过浸泡在抗蚀剂剥离液的卸载从坯料Si晶片的器件晶片。 清洁器件晶片，并使用食人鱼溶液（硫酸和过氧化氢在3：1的比率）的特征的0.5毫米厚的硼硅酸盐玻璃晶片。 通过阳极键合使用下列参数的玻璃和硅晶片密封流体通道：在350℃室压力在3mTorr，活塞压力在1000 N，温度，和应用750伏，直到电流降至低于0.2毫安。 切独立的芯片除了与切割锯金刚石锯片。 3.最终器件大会压电传感器附件注：超声是在微流体芯片通过连接到硅侧的压电陶瓷换能器产生的。 从ATWO组分低粘度环氧试剂盒，称出两种组分的推荐比例并彻底混合。 用移液管分配所述环氧树脂混合物和均匀地分布在整个一锆钛酸铅（PZT）的压电陶瓷以创建一个薄的，均匀的层（与37.5×10×0.5毫米尺寸的压电大约10微升环氧树脂混合物的）。 使用合适的夹具或固定装置，对齐压电陶瓷的环氧侧与微流体芯片，在一侧上用于随后导线连接（ 见图 2a）设一突出区，并把两个部件接触。夹紧组件在一个副，注意不要产生裂纹的任何组件，并且固化在推荐的环氧制造商的温度和持续时间。 之后环氧树脂固化后，附加细规格导线导致压电陶瓷的每一侧，通过用细尖烙铁焊接，使得与压电最短的可能的接触，以避免吨hermally去极化它。或者，使用导电性粘接剂粘合线到压电。 图2.流控面包板，芯片贴装，与世界到芯片接口。照片（一）声学微流控芯片（70×9×1毫米外尺寸）附带压电传感器引线，表现出分离的三关信道下来的芯片，（二）定制流体螺纹接头和机加工管部件为芯片到世界的接口，（三），其安装到使用夹紧装置，所述流体线路板的下侧的芯片，横跨在线路板中的开口，以允许风扇冷却，（d）该线路板与附加的管道连接和冷却风扇的顶视图， 和 （e）的螺纹接头的横截面示意图该接口的TUBI与安装的微流控芯片纳克。 请点击此处查看该图的放大版本。 设备的安装和世界到芯片接口该芯片连接到“流体试验板”（一盘的规则隔开的通孔螺纹一个网格）使用夹紧夹具。附加冷却风扇线路板，调节时声学实验的温度（ 参见图2）。 注：操作不受冷却风扇在典型的驱动电压升高，器件温度至70-80℃。这显著偏移的共振频率由于改变声速在流体，并可能正在处理的任何生物颗粒的可行性产生负面影响。 螺杆在芯片到世界的连接器，先前别处描述22和 图 2中所示。加入这些我覆盖整个院落管到附加管道的入口和出口使用标准¼“-28工会为1/16”管材。 声聚焦性能的4表征注：需要声聚焦表征系统组件组合在一起的材料清单。步骤4.1和4.2以下适用于借助这个平台使用的任何核心设备，而随后的步骤描述具体到本文所讨论的acoustofluidic设备操作。 系统配置组装用的流体线路板世界到片外连接的微流体芯片，作为使用管道（如1/16“外径含氟聚合物管），以一个流体泵和收集瓶在第3节进行连接所述。安装在能够搭载了CCD相机荧光成像显微镜阶段的线路板组装。 连小内地径的长度R（ID）的管道（0.006“建议）的芯片（见图4），以作为限流器，该稳定系统和控制芯片出口之间的流分离后立即使用。使用较大的ID管，如0.01“或者0.03”，对于所有其他连接。 估计每个管件的长度L和使用等式R H内径 D = 128 微升/πD4，其中 μ是流体的动态粘度的流体动力流动电阻 R 小时。压降ΔP由于管道的在给定的流量 Q的每个长度是由ΔP = QRħ给出。 选择的限流器的长度的比率为所使用的分离方法，以出口之间的流分割为适当。最佳的分离与本协议中的声学芯片需要一个SPO：approxima的LPO流量比tely 65：35％。 选择的出口限流器的长度，使得它们的流体阻力比在系统（串联或并联适当求和）的其余部分的总电阻大至少3-4次。对于在这项工作中所使用的acoustophoresis装置，35管的长度和65厘米为LPO和SPO是合适的。 注意：仔细必须考虑到任何微流控核心设备的R H。对于我们的声聚焦的芯片在这项工作中，R h为低，由于其相对较大的通道尺寸，所以连接管阻力很容易超过它。对于具有较小的通道尺寸的设备，该芯片的电阻可以操纵系统管道的其余部分，在这种情况下，设计和芯片上的信道R H是控制这个协议的步骤1中的额外的考虑因素。详细设计的原则和指引可在文献中。23,24 系统验证检查是否漏水，以验证微流体装置具有无缺陷，所有管路连接被密封。根据需要用注射器通过入口管分配水，并监视在主信道的任何流体泄漏。 分配通过芯片已知体积，并测量从出口收集的体积，以确保的流量比被预期。从预期体积比的偏差可以指示在插座或漏连接之一堵塞。 为了保持系统的清洁和防止堵塞冲洗整个系统（流体管道和芯片）与前和运行的任何实验后适当的清洗溶液（例如，漂白，乙醇，水）。 在堵塞或堵塞在出口中的一个时，冲洗系统，同时堵塞了明确的出口，以清除堵塞。如果不成功，冲洗期间反向的流动方向，任选施加反向流动的快速脉冲（使用手动致动注射器）。最后，如​​果堵塞仍然无法去除，更换管子或芯片，是必要的。 频率扫描设置的声聚焦填旁通通道（ 见图 1）与流体例如去离子水，乙醇，或磷酸盐缓冲盐水（PBS）通过手动注射用注射器。请注意，此流体不接触到样品被处理。使用不同的旁路流体调节节点位置的细节别处16,17说明。简言之，如果节点需要更接近分隔壁，使用较低的密度旁路流体，如乙醇;为节点放置更靠近输入样本流，选择更致密流体，诸如甘油溶液。 使约0.​​01％的珠溶液（重量/体积）5-8微米的荧光聚合物珠粒悬浮在缓冲液如PBS中0.05％吐温-20和填充样品入口注射器与珠子溶液。填充缓冲区入口注射器用相同的缓冲液（这并不需要是相同的流体中的旁通流路）。请注意，在一般情况下，缓冲器被选择以适合应用（参见步骤5.1）。 用显微镜舞台上的流体线路板，只需用两个通道（分离和旁路）中的视场中的出口之前集中大约一半到通道的深度处的直通道区域。一个附加的倾斜角度的外部光源可能需要使通道壁可见，对于成功的后处理的图像数据。 自动频率扫描和图像捕获使用屏蔽电缆（例如，RG-58配备BNC连接器），以与射频（RF）放大器的函数发生器来提供激励信号到压电换能器的电连接。可选，连接示波器为监视实际电压的函数发生器的输出施加到换能器。 开启冷却风扇，并设定功能发生器，使得RF放大器的到压电换能器的输出是在12-25的范围内伏峰-峰（V pp的）。 设置两个注射器之间50和200μl/ min的相同的流速。使用单一注射泵以相同的电机驱动两个注射器，建议以最小化扰动的流动。 通过指定的开始和结束频率，频率值之间的步长大小，和压电驱动电压使用实验室自动化工具如美国国家仪器公司的LabVIEW执行频率扫描过程。 在每一频率步进，施加电压15秒，以允许系统达到平衡，然后捕获10图像流经芯片用于随后的分析珠（曝光时间在10和100毫秒之间，建议）。 Ë之间ACH施加频率步骤，关闭电压为约20秒，让珠子重新分布均匀地在整个信道和从先前施加频率步骤聚焦除去偏倚。 图像分析，以确定谐振频率和聚焦位置运行图像分析脚本（比如提供与本议定书​​的AF_freqScanPlotter.m MATLAB脚本），并在提示输入所需的信息：请选择步骤4.4生成的图像文件的列表，进入扫描起始和终止频率和步长，全信道宽度，壁的位置，最后选择的图像区域来分析，包括分离和旁路通道。 观察分析脚本平均设定在每个频率步捕获的图像，并沿流动方向的平均强度值。这导致荧光强度的横截面线扫描。 注：对应于解释第1条的频率圣强度被定义为谐振频率（图3，中间行），并在那里发生的最高强度是聚焦位置 （图3，底行）的信道的位置。 图3代表性频率扫描。实施例的频率扫描数据以及耦合（A）和耦合不良（B）的压电和芯片。上排：珠荧光强度（红色代表高，而蓝色代表低强度）。中间一排：在每个频率最大强度。下排：最大强度，在这里，红色虚线表示预测聚焦位置的位置，和红色菱形表示如由最大强度确定谐振频率。G“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。 5.自动分离注意：所述的自动分离试验运行，从小颗粒大颗粒由于在微流体芯片施加的大小相关的声学聚焦力分开。所需要的系统的组件组合在一起的材料清单。 系统配置和样品制备微流体芯片连接到注射泵，计算机控制的多端口选择阀，PC的接口流量计，和油管， 如图4，这种配置使得能够通过微流体分离芯片的自动化的样品处理，以及自动清洗实验的步骤，消除交叉污染和样品结转。 使用适合的细胞或颗粒的样品缓冲液被分离，或所要求的分析测定以分离后使用。如步骤4.3.2，回收缓冲液（但不一定是旁路流体）必须样品流体匹配。 注意：任何水性缓冲液通常与生物样品（例如，PBS）中具有类似于水的声学特性，并且不会明显改变声学装置的性能。的使用，用密度和粘度显著不同于水样流体，为可能的，但只推荐用于显著acoustophoresis经验运营商。 图4.声学系统配置用于自动分离试验。蓝线通过系统跟踪主流路。所有绿色和黑色线是0.03“内径（ID）油管，以及所有的蓝色和灰色色线是0.01”ID管，与电子xception的保持线圈，它们是0.03“ID，以及限流器，它是0.006”的ID。该注射器都充满了缓冲区，并且保持线圈有足够的体积（550微升），以防止任何样品或清洁剂进入注射器的摄取。 请点击此处查看该图的放大版本。 分离过程预运行状态。前运行的分离，确保清洗试剂容器（漂白，乙醇，缓冲液）中有足够的流体，废弃储层不充分，而流体管线都准备（即，填充有溶液）。如果后者条件是不确定的，或者如果系统被空转之后被首次运行时间 （例如，在第一时间在某一天），运行一个自动清洁过程（见下面的步骤5.3）。设置阀3和4在芯片插座流到浪费RESErvoirs开始。 开启冷却风扇，并设定功能发生器在谐振频率用于声音芯片被使用时，如在步骤4.5确定。调节电压设定点的函数发生器，以便在12和25 V pp的RF放大器的输出，以适合所希望的分离。 连接样例输入样品瓶，缓冲器输入样品瓶，并适当收集瓶到系统。只需连接样品输入小瓶其动作油管前，涡旋小瓶简单地重​​新暂停，可能已经解决任何颗粒。然后，将小瓶并启动分离程序刻不容缓。 注意：如果要处理的样品含有潜在感染剂，小瓶应该是一个螺旋盖式的，以​​保持密封的系统和防止样品气雾。此外，生物危险材料的工作时，处理所有小瓶和管而穿着必要的防护用品，并使用REQuired风险控制措施和程序的生物危险组和生物安全水平适当的物质。咨询机构的政策和方案的情况下，任何的不确定性。 使用程序在实验室自动化工具包，以控制阀，流量传感器和泵进行全自动分离程序。 注：程序切换阀，驱动注射泵撤出和输液，并监视流量传感器的数据进行正确的时序输出采样馏分收集。主要步骤在5.2.4.1总结如下通过5.2.4.3，仿佛手工进行。 总理的皮卡管。从采样输入样品瓶撤回大约15微升完全填满它同时连接到阀1.管，素连接缓冲器输入到样品瓶阀2以类似的方式在管中，阀1素空气入口，以确保它不包含任何液体。最后，开关阀1和2驱逐浪费任何过量的流体或空气已进入负载线圈。 加载样品线圈， 如图5a所示。用于处理250微升样品的典型装载顺序是撤回25μl的空气，在50微升/分钟，然后加入250微升样品以200μl/分钟，接着以35微升主导缓冲液以200μl/分钟，最后另外的25微升的空气以50μl/分钟。 注：所有卷和流速是用户可选择的。请注意，此装载顺序是在如何流体插头将流过分离装置相反的顺序。 样品开始输液。设定注射器泵注入所装载的流体塞在所希望的速率（通常为100微升/分钟）。监测流率在SPO和LPO与流量传感器，以确保流动稳定并且在步骤4.1中确定的比率，而堵塞未发生。 收集分离的部分。当流量传感器检测流量激增，表明PA的第一空气间隙ssage，切换从废物的相应输出阀（其中，它开始在步骤5.2.1）至样品收集瓶中。 样品从芯片通过后，观察流量传感器检测所述第二空气间隙。此时，切换输出阀回浪费。之后从步骤5.2.4.2加载的全卷被分配，停止注射泵注入，并终止例行程序自动化当流量达到零。 分离实验完成后，断开SPO和LPO的样品收集瓶，并适当存储它们用于随后的分析。 自动清洁和去污注：在处理每个样品，冲洗并用下面的自动化程序净化整个流体系统。 固定SPO和LPO的收集瓶管，以及在空小瓶样品拾取管来收集将被刷新THROU过量的清洗液GH管。 启动自动系统清理程序。如同在步骤5.2的自动分离过程，程序应该控制阀和注射泵依次加载保持线圈与清洁试剂，并通过系统冲洗。 用10％的漂白剂冲洗，然后用70％乙醇，并与水或适当的缓冲盐水结束（例如，1×PBS或缓冲液用于样品处理）：执行以下清洗例程。使用以下冲洗量：450微升为漂白剂和乙醇，和1000微升的水/缓冲。 期间冲洗步骤，冲洗各试剂进SPO而LPO出口阀被设定为被阻止的端口，然后，反之亦然，以除去任何潜在的堵塞，在出口限流器。保持300-500微升/分钟的撤出和输注流速，以尽量减少产生气泡管中及背压累积时，无论是SPO或LPO被阻塞。 DISCARD多余的冲洗解决方案，并在他们收集按照适当的程序处理生物或化学废物的小瓶。