酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
間葉系幹細胞（MSC）は、再生医療及び組織工学における主要な役割を果たしている。彼らは彼らに自家療法の2,3のための理想的な候補をレンダリングしている、様々な細胞タイプ1に分化し、生着、移行することができます。最近、骨および軟骨修復のためのMSCを用いた臨床試験は、宿主病または心臓病、移植片対4を立ち上げた。これらのMSCは、臍帯または脂肪組織から採取することができるが、最も有望な結果は、骨髄由来の幹細胞5から得られた。
腸骨稜は、骨髄のかなりの量を収集することができ、したがって、吸引6の主な部位として働く。しかし、吸引の品質を回収骨髄の体積の増加に伴って減少する。骨髄穿刺液の最初の5mlを、高品質のMSCを含み、一方、より大量の撤退は、末梢血fの吸引物の希釈につながる高度に血管骨7を挿入します。抗凝固剤を使用しない場合は、そのため、本巨核球及び血小板の、骨髄吸引物は、凝固する傾向がある。しかし、たとえ抗凝固剤で、血栓が発生することがあります。
骨髄では、MSCは、全細胞プール8のごく一部を表し、ほとんどの組織工学または治療用途4培養中で増殖しなければならない。そのような文化が大きくすなわち 、初期の細胞プールに依存している。、多様性と高始動番号9の品質。引き出しからMSCの低い数字は、部分的にドナーの変動によって説明することができる。一方、低品質のサンプルからのMSCは、所望の細胞数に到達するために培養においてより長い時間を延長継代を必要とする。いずれの場合も、拡張継代は、細胞老化の源であり、10の潜在的分化の喪失につながる可能性がある。したがって、セルyを最大化することができるプロトコルを最適化ieldと有害な影響を防ぐには、11,12を開発しなければならない。
私たちは、犬のMSCとの仕事を始めたとき、私たちは幸いに凝固したヒトサンプル（10人に1）はあまり頻繁であったが約3〜4におけるイヌの骨髄サンプルは、血栓が含まれているのを見て驚いた。一方で、それは我々が凝固したサンプルからのMSCのはるかに低い収量を観察していることを、全く驚きませんでした。凝固したサンプルの定期的な問題を解決するために、我々は代わりにリサンプリングの血栓溶解薬ウロキナーゼを使用してプロトコルを開発しました。
血栓溶解療法は、心臓発作、脳卒中ため、または不要な凝固の塞栓症の原因となる血管の閉塞などの生命を脅かす状況に対抗することができます。彼らは、プラスミンおよび酵素プラスミノーゲン活性化因子によるフィブリンの酵素的切断を通して血栓の分解によって働く。患者の治療のための幅広い使用にもかかわらず、ごく少数の出版物は、その利用血栓溶解活性を存在実験室でのアプリケーションは、凝固したサンプルを救出するために、主にリンパ球に焦点を当てた。 1987年、肉じゃがら 。 13と4年後の機能的なリンパ球になり、血栓を溶解するためのストレプトキナーゼの使用を記載し、デ·ヴィスら 。フローサイトメトリーアプリケーション14のための血液および骨髄からの白血病細胞を単離するためのストレプトキナーゼの使用を拡張する。より最近の刊行物は、癌の診断15アルテプラーゼの使用を示唆している。同じ酵素アプローチを使用している間、私たちのプロトコルは、多能MSCの分離に焦点を当てて、幹細胞分野の研究者のためのツールを提供するために、骨髄を形成する。
Protocol
Representative Results
Discussion
患者は少しだけ追加作業が手術室に人員によって行わなければならない利点と、（我々の場合、主に手術を背骨）手術を受けている間に定期的に、我々は、骨髄をサンプリングする。サンプルはすぐに撤退した後、クエン酸ナトリウムと混合されるにもかかわらず、彼らは、処理のために研究室に到着したとき、多くのサンプルが部分的に凝固しただった。この段階では、凝固した標本?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research–bench to bedside and back–myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
