Summary

酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する

Published: April 12, 2015
doi:

Summary

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Introduction

間葉系幹細胞(MSC)は、再生医療及び組織工学における主要な役割を果たしている。彼らは彼らに自家療法の2,3のための理想的な候補をレンダリングしている、様々な細胞タイプ1に分化し、生着、移行することができます。最近、骨および軟骨修復のためのMSCを用いた臨床試験は、宿主病または心臓病、移植片対4を立ち上げた。これらのMSCは、臍帯または脂肪組織から採取することができるが、最も有望な結果は、骨髄由来の幹細胞5から得られた。

腸骨稜は、骨髄のかなりの量を収集することができ、したがって、吸引6の主な部位として働く。しかし、吸引の品質を回収骨髄の体積の増加に伴って減少する。骨髄穿刺液の最初の5mlを、高品質のMSCを含み、一方、より大量の撤退は、末梢血fの吸引物の希釈につながる高度に血管骨7を挿入します。抗凝固剤を使用しない場合は、そのため、本巨核球及び血小板の、骨髄吸引物は、凝固する傾向がある。しかし、たとえ抗凝固剤で、血栓が発生することがあります。

骨髄では、MSCは、全細胞プール8のごく一部を表し、ほとんどの組織工学または治療用途4培養中で増殖しなければならない。そのような文化が大きくすなわち 、初期の細胞プールに依存している。、多様性と高始動番号9の品質。引き出しからMSCの低い数字は、部分的にドナーの変動によって説明することができる。一方、低品質のサンプルからのMSCは、所望の細胞数に到達するために培養においてより長い時間を延長継代を必要とする。いずれの場合も、拡張継代は、細胞老化の源であり、10の潜在的分化の喪失につながる可能性がある。したがって、セルyを最大化することができるプロトコルを最適化ieldと有害な影響を防ぐには、11,12を開発しなければならない。

私たちは、犬のMSCとの仕事を始めたとき、私たちは幸いに凝固したヒトサンプル(10人に1)はあまり頻繁であったが約3〜4におけるイヌの骨髄サンプルは、血栓が含まれているのを見て驚いた。一方で、それは我々が凝固したサンプルからのMSCのはるかに低い収量を観察していることを、全く驚きませんでした。凝固したサンプルの定期的な問題を解決するために、我々は代わりにリサンプリングの血栓溶解薬ウロキナーゼを使用してプロトコルを開発しました。

血栓溶解療法は、心臓発作、脳卒中ため、または不要な凝固の塞栓症の原因となる血管の閉塞などの生命を脅かす状況に対抗することができます。彼らは、プラスミンおよび酵素プラスミノーゲン活性化因子によるフィブリンの酵素的切断を通して血栓の分解によって働く。患者の治療のための幅広い使用にもかかわらず、ごく少数の出版物は、その利用血栓溶解活性を存在実験室でのアプリケーションは、凝固したサンプルを救出するために、主にリンパ球に焦点を当てた。 1987年、肉じゃが13と4年後の機能的なリンパ球になり、血栓を溶解するためのストレプトキナーゼの使用を記載し、デ·ヴィス 。フローサイトメトリーアプリケーション14のための血液および骨髄からの白血病細胞を単離するためのストレプトキナーゼの使用を拡張する。より最近の刊行物は、癌の診断15アルテプラーゼの使用を示唆している。同じ酵素アプローチを使用している間、私たちのプロトコルは、多能MSCの分離に焦点を当てて、幹細胞分野の研究者のためのツールを提供するために、骨髄を形成する。

Protocol

注:腸骨稜からのヒト骨髄吸引は、ルツェルン州の倫理委員会の承認を得てドナー同意から採取した。犬の所有者のconsent.Human(約20ml)およびイヌ(約10ml)を骨髄穿刺液を直ちに中止後に3.8%クエン酸ナトリウムを15mlの添加により抗凝固して腸骨稜からイヌ骨髄吸引物を採取した手術室で。試料を回収と同日処理する実験室の環境に移した。 ウロキナーゼの調製(従来1?…

Representative Results

と一緒に、彼らは私たちの研究室( 図1A)に到着したとき、犬の骨髄サンプルの74パーセント(N = 54)は血栓を含んでいたことの事実は、私たちはMSCの相当数が、血栓内に捕捉されたと信じていた、これらのサンプルからMSC利回りの低下。実際に、切片凝固材料の単純なDAPI染色は、高密度( 図1B)中の有核細胞の存在を確認する。これは最終的にウロキナーゼを使用…

Discussion

患者は少しだけ追加作業が手術室に人員によって行わなければならない利点と、(我々の場合、主に手術を背骨)手術を受けている間に定期的に、我々は、骨髄を​​サンプリングする。サンプルはすぐに撤退した後、クエン酸ナトリウムと混合されるにもかかわらず、彼らは、処理のために研究室に到着したとき、多くのサンプルが部分的に凝固しただった。この段階では、凝固した標本?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.

Materials

Basal Medium Components
PenStrep 100X Gibco 15140122
Human FGF-basic Peprotech 100-18B
MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine Amimed 1-23S50-I
FBS Heat Inactivated Amimed 2-01F36-I
Amphotericin B Applichem A1907
Adipogenic Medium Components
DMEM-HAM F12 + GlutaMAX Amimed 1-26F09-I
Insulin  Sigma I5500
Rabbit serum  Gibco 16120099
Dexamethasone Applichem D4902
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
Biotin  Sigma B4639
Rosiglitazone  Sigma R2408
Pantothenate  Sigma P5155
Oil Red-O  Sigma O0625
Osteogenic Medium Components
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
ß-glycerophosphate Sigma G9422
Silver nitrate (AgNO3) Sigma S6506
Chondrogenic Medium Components
Biopad – sponge shaped medical device  Euroresearch
L-proline  Sigma P5607
Insulin-Transferrin-Selenium X Gibco 51500056
Human transforming growth factor-β1  Peprotech 100-21
Alcian Blue 8GX Sigma A3157
Nuclear fast red Sigma N8002
Generic
Tri-Sodium citrate dihydrate Applichem A3901
PBS Applichem 964.9100
Urokinase Medac 1976826
0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400054
Giemsa stain Applichem A0885
Formaldehyde Applichem A0877
Sulfuric acid (H2SO4) Applichem A0655
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A1584
Magnesium chloride (MgCl2) Applichem A3618
Guanidine hydrochloride Applichem A1499
Consumables
50 mL reaction tube Axygen SCT-50ML-25-S
10 mL syringe Braun 4606108V
Sterican needle (22G) Braun 4657624
1.7 mL Microtubes Brunschwig MCT-175-C
100 μm cell strainer Falcon 6.05935
sterile forceps Bastos Viegas, SA 489-001
sterile scalpel Braun 5518059
Primaria cell cuture dish Falcon 353803
C-Chip Neubauer Improved Bioswisstech 505050
cell culture flask – Flask T300 TPP 90301
Equipment
Microbiological biosafety cabinet class II Skan 82011500
water bath Memmert 1305.0377
Stripettes Serological Pipette 5ml Corning 4487-200ea
microscope Olympus CKX41
humidified incubator Heracells 240 Thermo scientific 51026331
Heraeus Multifuge 1S-R Thermo scientific 75004331

References

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Cite This Article
Schlaefli, P., Bertolo, A., Malonzo, C., Poetzel, T., Baur, M., Steffen, F., Stoyanov, J. An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples. J. Vis. Exp. (98), e52694, doi:10.3791/52694 (2015).

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