Une méthode enzymatique pour secourir Cellules souches mésenchymateuses à partir d'échantillons coagulés moelle osseuse
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) jouent un rôle majeur dans la médecine régénérative et de l'ingénierie tissulaire. Ils peuvent migrer, se différencier en différents types de cellules et une greffer, ce qui les rend idéales pour les candidats thérapies autologues 2,3. Dernièrement, des essais cliniques utilisant MSC pour les os et la réparation du cartilage, maladie du greffon contre l'hôte ou une maladie cardiaque ont été lancés 4. Ces cellules souches mésenchymateuses peuvent être récoltées à partir du tissu du cordon ombilical ou adipeux, mais les résultats les plus prometteurs ont été obtenus à partir de la moelle osseuse les cellules souches dérivées 5.
La crête iliaque permet de recueillir une quantité considérable de la moelle osseuse et sert donc de site principal d'aspiration 6. Cependant, la qualité de l'aspiration diminue avec l'augmentation du volume de la moelle osseuse retirée. Alors que les cinq premiers ml de ponction de la moelle osseuse contiennent MSC de haute qualité, le retrait de volumes plus importants conduit à une dilution de l'aspiration avec sang périphérique fepuis l'os très vascularisé 7. En raison de la présente des mégacaryocytes et des plaquettes, des aspirats de moelle osseuse sont sujettes à la coagulation, à moins que les anticoagulants sont utilisés. Mais même avec des anticoagulants, des caillots peuvent se produire.
Dans la moelle osseuse, cellules souches mésenchymateuses ne représentent qu'une faible proportion de la piscine total de cellules 8 et doivent être multipliées en culture pour la plupart ingénierie tissulaire ou quatre applications thérapeutiques. La qualité d'une telle culture dépend largement de la piscine de la cellule initiale, ce est à dire., La diversité et une grande départ numéro 9. De faibles effectifs d'MSC de retraits peuvent se expliquer en partie par la variabilité des bailleurs de fonds. D'autre part, les CSM à partir d'échantillons de faible qualité nécessitent plus de temps dans la culture et repiquage prolongé pour atteindre le nombre souhaité de cellules. Dans les deux cas, des passages est une source étendue de la sénescence cellulaire et peut conduire à la perte de potentiel de 10 différenciation. Par conséquent, les protocoles qui peuvent maximiser cellulaire y optimiséield et prévenir des effets néfastes doivent être développés 11,12.
Lorsque nous avons commencé à travailler avec MSC canines, nous avons été étonnés de voir que les échantillons de moelle osseuse canines environ trois sur quatre contenaient des caillots, tandis que les échantillons humains heureusement coagulé (un sur dix) ont été moins fréquentes. D'autre part, il ne est pas surprenant, que nous avons observé des rendements beaucoup plus faibles de MSC à partir d'échantillons coagulés. Pour résoudre le problème récurrent des échantillons coagulés, nous avons développé le protocole utilisant l'urokinase de drogue thrombolytique lieu de rééchantillonnage.
Thérapies thrombolytiques peuvent contrecarrer les situations de la vie en danger, comme l'occlusion des vaisseaux sanguins provoquant une crise cardiaque, accident vasculaire cérébral ou embolie raison de coagulation non désirée. Ils fonctionnent par la dégradation des caillots par clivage enzymatique par la plasmine de la fibrine et du plasminogène activateurs enzymatiques. Malgré la large utilisation pour le traitement des patients, que très peu de publications existent que les activités thrombolytiques utiliséspour les applications de laboratoire pour sauver échantillons coagulés, en se concentrant principalement sur les lymphocytes. En 1987, Niku et al. décrit l'utilisation de streptokinase pour dissoudre les caillots sanguins dans les lymphocytes fonctionnels résultant 13 et quatre ans plus tard, De Vis et al. étendu l'utilisation de la streptokinase pour isoler les cellules leucémiques dans le sang et la moelle osseuse pour des applications de cytométrie en flux 14. Une publication plus récente suggère l'utilisation de Alteplase pour le diagnostic de cancer 15. Tout en utilisant la même approche enzymatique, notre protocole met l'accent sur l'isolement des cellules souches mésenchymateuses multipotentes forme la moelle osseuse de fournir un outil pour les chercheurs dans le domaine des cellules souches.
Protocol
Representative Results
Discussion
Régulièrement on échantillonne moelle osseuse tandis que le patient subit une intervention chirurgicale (dans notre cas de chirurgie principalement la colonne vertébrale), avec l'avantage que seul le travail peu supplémentaire doit être effectué par le personnel de la salle d'opération. Même si les échantillons sont mélangés avec du citrate de sodium immédiatement après le retrait, de nombreux échantillons ont été partiellement coagulé quand ils sont arrivés dans le laboratoire pour le traitem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
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