Un método enzimático para rescatar a las células madre mesenquimales de médula ósea Las muestras Clotted
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
Las células madre mesenquimales (MSCs) juegan un papel importante en la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos. Ellos pueden migrar, diferenciarse en diversos tipos de células 1 y injertarse, lo que les hace candidatos ideales para las terapias autólogas 2,3. Últimamente, los ensayos clínicos con MSC para la reparación de hueso y cartílago, se lanzaron enfermedad injerto contra huésped o enfermedad cardíaca 4. Estos MSCs se pueden cosechar a partir del tejido del cordón umbilical o tejido adiposo pero los resultados más prometedores se obtuvieron a partir de la médula ósea células madre derivadas 5.
La cresta ilíaca permite recoger una cantidad considerable de médula ósea y por lo tanto sirve como sitio principal de la aspiración 6. Sin embargo, la calidad del aspirado disminuye con el aumento de volumen de la médula ósea retirada. Mientras que los primeros 5 ml de aspirado de médula ósea contienen MSCs de alta calidad, la retirada de volúmenes más grandes conduce a la dilución de la sangre periférica con aspirado de fesde el hueso altamente vascularizado 7. Debido a los presentes megacariocitos y plaquetas, aspirado de médula ósea son propensos a la coagulación, a menos que se utilizan anticoagulantes. Pero incluso con anticoagulantes, se pueden producir coágulos.
En la médula ósea, MSCs representar sólo una pequeña proporción de la piscina total de células 8 y tienen que ser expandida en cultivo durante más de ingeniería de tejidos o aplicaciones terapéuticas 4. La calidad de una cultura de este tipo depende en gran medida de la piscina célula inicial, es decir., La diversidad y un alto número de partida 9. Los números bajos de las MSC de retiros pueden explicarse en parte por la variabilidad de los donantes. Por otro lado, las MSC de muestras de baja calidad requieren más tiempo en la cultura y pases extendido para alcanzar el número deseado de células. En cualquier caso, los pases extendida es una fuente de la senescencia celular y puede conducir a la pérdida de la diferenciación potencial 10. Por lo tanto, los protocolos que pueden maximizar celular y optimizadoield y prevenir los efectos perjudiciales tienen que desarrollarse 11,12.
Cuando empezamos a trabajar con las MSC caninos, nos quedamos asombrados al ver que alrededor de tres de cada cuatro muestras de médula ósea canina contenían coágulos, mientras que las muestras humanas afortunadamente coagulada (uno de cada diez) fueron menos frecuentes. Por otra parte no fue una sorpresa, que observamos rendimientos mucho más bajos de las MSC de muestras coaguladas. Para resolver el problema recurrente de muestras coaguladas, hemos desarrollado el protocolo mediante el uroquinasa fármaco trombolítico en lugar de remuestreo.
Terapias trombolíticos pueden contrarrestar situaciones que amenazan la vida tales como la oclusión de los vasos sanguíneos que causan ataques cardiacos, derrames cerebrales o embolias debido a la coagulación no deseada. Trabajan por la degradación de los coágulos a través de la escisión enzimática de la fibrina por la plasmina y de plasminógeno enzimática activadores. A pesar de la amplia utilización para el tratamiento de los pacientes, sólo existen muy pocas publicaciones que las actividades trombolíticos utilizadospara aplicaciones de laboratorio para rescatar muestras coaguladas, centrándose sobre todo en los linfocitos. En 1987, Niku et al. describe el uso de estreptoquinasa para disolver los coágulos de sangre que resulta en linfocitos funcionales 13 y cuatro años más tarde, De Vis et al. extendido el uso de estreptoquinasa para aislar las células leucémicas de la sangre y la médula ósea para aplicaciones de citometría de flujo 14. Una publicación más reciente sugiere el uso de alteplasa para el diagnóstico del cáncer 15. Mientras utiliza el mismo enfoque enzimática, nuestro protocolo se centra en el aislamiento de multipotentes MSC forma médula ósea para proporcionar una herramienta para los investigadores en el campo de las células madre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rutinariamente muestra de médula ósea, mientras que el paciente está sometido a cirugía (en nuestro caso la cirugía, principalmente la columna vertebral), con la ventaja de que sólo poco trabajo adicional tiene que ser llevada a cabo por el personal de la sala de operaciones. A pesar de que las muestras se mezclan con citrato de sodio inmediatamente después de la retirada, muchas muestras fueron parcialmente coagulada cuando llegaron en el laboratorio para su procesamiento. En esta etapa, el remuestreo para reemp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research–bench to bedside and back–myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
