Bir Enzimatik Yöntem Kaymaklı Kemik İliği Örneklerinden Mezenkimal Kök Hücreler Kurtarma
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
Mezenkimal kök hücreler (MKH) rejeneratif tıp ve doku mühendisliğinde önemli bir rol oynamaktadır. Onlara otolog tedaviler 2,3 için ideal bir aday kılan, hangi çeşitli hücre tipleri 1 içine ayırt ve aşılamak, göç edebilir. Son zamanlarda, kemik ve kıkırdak onarımı için MKH'lerin kullanarak klinik çalışmalarda, host hastalığı veya kalp hastalığı greft versus 4 başlatıldı. Bu MSC'ler göbek kordonu ya da yağ dokusu hasat edilir, ancak en fazla umut vaat eden sonuçlar kemik iliğinden elde edilen kök hücreleri 5 elde edilmiştir.
iliak kemik iliği önemli miktarda toplamak için izin verir ve bu nedenle aspirasyon 6 ana site olarak hizmet vermektedir. Ancak, aspirat kalitesi çekilen kemik iliği hacmini artması ile azalmaktadır. Kemik iliği aspirasyon ilk 5 ml kaliteli MKH'lerin ihtiva ederken, daha büyük hacimli çekilmesi periferik kan f aspirat seyreltme yol açarçok kanlanan kemik 7 rom. Antikoagülan kullanıldığı sürece Çünkü mevcut megakaryositlerin ve trombosit, kemik iliği aspirasyon, pıhtılaşma yatkındır. Ama bile antikoagülan, pıhtıları oluşabilir.
Kemik iliğinde, MKH toplam hücre havuzunun 8 sadece küçük bir kısmını temsil ve birçok doku mühendisliği veya terapötik uygulamalar 4 kültür genişletilmiş gerekir. Böyle bir kültürün kalitesi büyük ölçüde ilk hücre havuzu, yani bağlıdır., çeşitlilik ve yüksek başlangıç numarası 9. Çekme gelen MKH Düşük sayılar kısmen donör değişkenliği ile açıklanabilir. Diğer taraftan, düşük kaliteli örneklerinden MKH hücre istenilen sayıda ulaşmak için kültürde uzun süre ve genişletilmiş Pasajlanması gerektirir. Her iki durumda da, uzun pasajı hücre yaşlanmasının kaynağıdır ve 10, potansiyel farklılaşmanın aşamalı olarak kaybına yol açabilir. Bu nedenle, hücre y maksimize protokolleri optimizeield ve zararlı etkileri 11,12 geliştirilmesi gerekmektedir engellemek.
Biz köpek MSC ile çalışmaya başladığında neyse pıhtılaşmış insan örnekleri (on bir) daha az sıklıkta iken, biz, yaklaşık üç dört köpek kemik iliği örnekleri pıhtıları içerdiğini görmek için şaşkın. Öte yandan biz pıhtılaşmış örneklerinden MKH çok daha düşük verim gözlenen, hiçbir sürpriz oldu. Pıhtılaşmış numuneler tekrarlanan sorunu çözmek için, biz yeniden örnekleme yerine trombolitik ilaç urokinez kullanarak protokolü geliştirdi.
Trombolitik tedavi, kalp krizi, felç nedeniyle veya istenmeyen pıhtılaşma embolileri neden kan damarlarının tıkanması gibi hayatı tehdit eden durumları ortadan edebilirsiniz. Onlar plazmin ve enzimatik plazminojen aktivatörleri ile fibrin enzimatik bölünme yoluyla pıhtıların bozulması ile çalışır. Hastaların tedavisi için geniş kullanım rağmen, sadece çok az yayın çok kullanılan trombolitik faaliyetler olduğunu varLaboratuvar uygulamaları pıhtılaşmış numuneler kurtarmak için, çoğunlukla lenfositler üzerinde duruluyor. 1987 yılında, Niku ve ark. 13 ve dört yıl sonra fonksiyonel lenfosit sonuçlanan kan pıhtıları eriterek streptokinaz kullanımını tarif De Vis ark. Akış sitometri uygulamaları 14 kan ve kemik iliğinden lösemi hücreleri izole etmek için streptokinaz kullanımı genişletilmiş. Daha yeni bir yayın kanser teşhisinde 15 Alteplaz kullanımını önermektedir. Aynı enzimatik yaklaşımı kullanırken, bizim protokol kök hücre alanındaki araştırmacılar için bir araç sağlamak için multipotent MKH formu kemik iliği izolasyonu üzerinde duruluyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasta sadece küçük bir ek iş ameliyathanede personel tarafından yapılmalıdır avantajı ile, (bizim durumumuzda özellikle omurga cerrahisi olarak) ameliyat geçiren iken rutin kemik iliği örnek. Numuneler hemen çekilmesinden sonra, sodyum sitrat ile karıştırılır olsa onlar işleme laboratuarda geldi, birçok örnekleri kısmen pıhtılaşmış idi. Bu aşamada, pıhtılaşmış numuneler yerine örnekleme ayrı bir ek müdahale yine yerel veya genel anestezi gerektiren 6 olacaktır. Bu katkı,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research–bench to bedside and back–myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
