Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) svolgono un ruolo importante nella medicina rigenerativa e dell'ingegneria dei tessuti. Essi possono migrare, differenziarsi in vari tipi di cellule 1 e innestare, che li rende i candidati ideali per terapie autologhe 2,3. Ultimamente, gli studi clinici che utilizzano cellule staminali mesenchimali per la riparazione delle ossa e della cartilagine, graft versus host disease o malattia cardiaca sono stati lanciati 4. Questi MSC possono essere raccolte dal tessuto adiposo o cordone ombelicale, ma i risultati più promettenti sono stati ottenuti da midollo osseo cellule staminali derivate 5.
La cresta iliaca permette di raccogliere una notevole quantità di midollo osseo e serve quindi come sito principale di aspirazione 6. Tuttavia, la qualità del aspirato diminuisce con l'aumento del volume di midollo osseo prelevato. Mentre i primi 5 ml di midollo osseo contengono cellule staminali mesenchimali di alta qualità, ritiro delle maggiori volumi porta alla diluizione del aspirato con sangue periferico fROM l'osso altamente vascolarizzato 7. A causa delle attuali megacariociti e piastrine, aspirati di midollo osseo sono inclini a coagulazione, a meno di utilizzare anticoagulanti. Ma anche con anticoagulanti, possono verificarsi la formazione di coaguli.
Nel midollo osseo, cellule staminali mesenchimali rappresentano solo una piccola parte del pool di cellule totale 8 e devono essere espansa in coltura per più ingegneria dei tessuti o applicazioni terapeutiche 4. La qualità di una tale cultura dipende in gran parte la piscina cellula iniziale, vale a dire., La diversità e un alto numero di partenza 9. Basso numero di cellule staminali mesenchimali da prelievi possono essere in parte spiegati dalla variabilità dei donatori. D'altra parte, MSC da campioni bassa qualità richiedono tempo maggiore di cultura e passaging esteso a raggiungere il numero desiderato di celle. In entrambi i casi, passaging esteso è fonte di senescenza cellulare e può portare alla perdita di differenziazione potenziale 10. Pertanto, i protocolli in grado di massimizzare cellulare y ottimizzatoield ed evitare effetti nocivi devono essere sviluppati 11,12.
Quando abbiamo cominciato a lavorare con MSC canina, siamo stati sorpresi di vedere che circa tre su quattro campioni di midollo osseo canini contenuti coaguli, mentre i campioni umani fortunatamente coagulato (uno su dieci) erano meno frequenti. D'altra parte è stata una sorpresa, che abbiamo osservato rendimenti molto più bassi di cellule staminali mesenchimali da campioni coagulati. Per risolvere il problema ricorrente dei campioni coagulati, abbiamo sviluppato il protocollo con il urokinase droga trombolitico invece di ricampionamento.
Terapie trombolitici possono contrastare in pericolo di vita situazioni come l'occlusione dei vasi sanguigni, causando un attacco di cuore, ictus o embolie a causa di coagulazione indesiderati. Funzionano degradazione dei coaguli attraverso taglio enzimatico di fibrina da plasmina e del plasminogeno attivatori enzimatici. Nonostante l'ampio uso per il trattamento di pazienti, solo pochissime pubblicazioni esistono che le attività trombolitici utilizzate, c'eper applicazioni di laboratorio per salvare campioni coagulati, soprattutto concentrandosi su linfociti. Nel 1987, Niku et al. descritto l'uso di streptochinasi per dissolvere i coaguli di sangue con conseguente linfociti funzionali 13 e quattro anni dopo, De Vis et al. esteso l'uso di streptochinasi per isolare cellule leucemiche dal sangue e del midollo osseo per le applicazioni di citometria a flusso 14. Una pubblicazione più recente suggerisce l'uso di Alteplase per la diagnostica del cancro 15. Mentre si utilizza lo stesso approccio enzimatico, il nostro protocollo si concentra su l'isolamento di cellule staminali mesenchimali multipotenti forma di midollo osseo per fornire uno strumento per i ricercatori nel campo delle cellule staminali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ordinariamente campioniamo midollo osseo mentre il paziente sta subendo chirurgia (nel nostro caso principalmente chirurgia della colonna vertebrale), con il vantaggio che solo il lavoro poco aggiuntiva deve essere effettuata da personale della sala operatoria. Anche se i campioni vengono mescolati con citrato di sodio immediatamente dopo il ritiro, molti campioni sono stati parzialmente coagulato quando sono arrivati in laboratorio per l'elaborazione. In questa fase, ricampionamento per sostituire i campioni …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
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