Summary

Um método enzimático para a Salvação da Células-Tronco Mesenquimais de amostras Clotted Medula Óssea

Published: April 12, 2015
doi:

Summary

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Introduction

As células estaminais mesenquimais (MSCs) desempenham um papel importante em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Eles podem migrar, diferenciar-se em vários tipos de células 1 e enxertar, o que os torna os candidatos ideais para terapias autólogos 2,3. Ultimamente, os ensaios clínicos utilizando MSCs de osso e cartilagem reparação, doença enxerto versus hospedeiro ou doença cardíaca foram lançados 4. Estes MSCs podem ser colhidas a partir do cordão umbilical, ou tecido adiposo, mas os resultados mais promissores foram obtidos a partir de medula óssea derivadas de células estaminais 5.

A crista ilíaca permite recolher uma quantidade considerável de medula óssea e, portanto, serve como local principal de aspiração 6. No entanto, a qualidade do aspirado diminui com o aumento de volume de medula óssea retirada. Enquanto os primeiros 5 ml de aspirado de medula óssea conter MSCs de alta qualidade, a retirada de volumes maiores leva a diluição do aspirado com sangue periférico fesde o osso altamente vascularizado 7. Devido às actuais megacariócitos e plaquetas, aspirados de medula óssea são propensas a coagulação, a menos que sejam utilizados anticoagulantes. Mas, mesmo com anticoagulantes, pode ocorrer a formação de coágulos.

Na medula óssea, as MSCs constituem apenas uma pequena proporção do conjunto total de 8 células e têm de ser expandidas em cultura para engenharia de tecidos ou mais aplicações terapêuticas 4. A qualidade de uma tal cultura depende em grande parte do conjunto de células inicial, isto é., A diversidade e um elevado número de partida 9. Baixo número de MSCs de levantamentos pode ser parcialmente explicado pela variabilidade dos doadores. Por outro lado, as MSCs a partir de amostras de baixa qualidade requerem mais tempo em cultura e passagem em estendida para atingir o número desejado de células. Em ambos os casos, passaging estendido é uma fonte de senescência celular e pode levar à perda de potencial de diferenciação 10. Portanto, os protocolos que podem maximizar celular y otimizadoield e prevenir contra os efeitos prejudiciais têm de ser desenvolvidas 11,12.

Quando começamos a trabalhar com MSCs caninos, ficamos surpresos ao ver que cerca de três em cada quatro amostras de medula óssea de cães contido coágulos, enquanto amostras humanas felizmente coagulado (uma em cada dez) foram menos freqüentes. Por outro lado não foi nenhuma surpresa, observou-se que os rendimentos muito mais baixos de MSCs a partir de amostras coaguladas. Para resolver o problema recorrente de amostras coaguladas, que desenvolveu o protocolo usando o urokinase droga trombolítica em vez de reamostragem.

Terapias trombolíticos pode neutralizar situações que ameaçam a vida, como a oclusão de vasos sanguíneos, provocando um ataque cardíaco, acidente vascular cerebral ou embolia devido a coagulação indesejada. Eles trabalham por degradação dos coágulos através da clivagem enzimática da fibrina pela plasmina e enzimática do plasminogênio ativadores. Apesar da ampla utilização para o tratamento de pacientes, apenas muito poucas publicações que existem atividades trombolíticos utilizadopara aplicações de laboratório para resgatar amostras coaguladas, focando principalmente nos linfócitos. Em 1987, Niku et al. descreveram o uso de estreptoquinase para dissolver coágulos de sangue, resultando em linfócitos funcionais 13 e quatro anos mais tarde, De Vis et al. estendeu o uso de estreptoquinase para isolar as células de leucemia de sangue e medula óssea para aplicações de citometria de fluxo 14. A publicação mais recente sugere o uso de Alteplase para diagnóstico de câncer 15. Enquanto estiver usando a mesma abordagem enzimática, nosso protocolo incide sobre o isolamento de multipotentes da medula óssea MSCs forma a fornecer uma ferramenta para os pesquisadores da área de células-tronco.

Protocol

NOTA: aspirados de medula óssea Humanos da crista ilíaca foram coletados de doadores consentindo com a aprovação do comitê de ética do cantão de Lucerna. Aspirados de medula óssea a partir de canino da crista ilíaca foram recolhidas com consent.Human do proprietário do cão (aprox. 20 ml) e canina (aprox. 10 ml), aspirados de medula óssea eram anti-coagulados por adição de 15 ml de citrato de sódio a 3,8% imediatamente depois da retirada no teatro operação. As amostras foram transferidas para o ambiente …

Representative Results

Os fatos que 74% das amostras de medula óssea de cães (n = 54) contidos coágulos quando chegaram em nosso laboratório (Figura 1A), juntamente com a diminuição da produtividade MSC partir dessas amostras, nos fez acreditar que um número considerável de MSCs foi preso dentro dos coágulos . Com efeito, uma simples DAPI-mancha de material de coágulo seccionado confirma a presença de células nucleadas em alta densidade (Figura 1B). E isso leva a baixos números de MSCs disponíve…

Discussion

Rotineiramente nós amostra da medula óssea, enquanto o paciente está a sofrer a cirurgia (no nosso caso, a cirurgia da coluna, principalmente), com a vantagem de que apenas pouco trabalho adicional tem de ser efectuada pelo pessoal na sala de cirurgia. Mesmo que as amostras são misturadas com citrato de sódio imediatamente após a retirada, muitas amostras foram parcialmente coagulado quando chegaram no laboratório para processamento. Nesta fase, resampling para substituir espécimes coagulados seria uma interven?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.

Materials

Basal Medium Components
PenStrep 100X Gibco 15140122
Human FGF-basic Peprotech 100-18B
MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine Amimed 1-23S50-I
FBS Heat Inactivated Amimed 2-01F36-I
Amphotericin B Applichem A1907
Adipogenic Medium Components
DMEM-HAM F12 + GlutaMAX Amimed 1-26F09-I
Insulin  Sigma I5500
Rabbit serum  Gibco 16120099
Dexamethasone Applichem D4902
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
Biotin  Sigma B4639
Rosiglitazone  Sigma R2408
Pantothenate  Sigma P5155
Oil Red-O  Sigma O0625
Osteogenic Medium Components
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
ß-glycerophosphate Sigma G9422
Silver nitrate (AgNO3) Sigma S6506
Chondrogenic Medium Components
Biopad – sponge shaped medical device  Euroresearch
L-proline  Sigma P5607
Insulin-Transferrin-Selenium X Gibco 51500056
Human transforming growth factor-β1  Peprotech 100-21
Alcian Blue 8GX Sigma A3157
Nuclear fast red Sigma N8002
Generic
Tri-Sodium citrate dihydrate Applichem A3901
PBS Applichem 964.9100
Urokinase Medac 1976826
0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400054
Giemsa stain Applichem A0885
Formaldehyde Applichem A0877
Sulfuric acid (H2SO4) Applichem A0655
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A1584
Magnesium chloride (MgCl2) Applichem A3618
Guanidine hydrochloride Applichem A1499
Consumables
50 mL reaction tube Axygen SCT-50ML-25-S
10 mL syringe Braun 4606108V
Sterican needle (22G) Braun 4657624
1.7 mL Microtubes Brunschwig MCT-175-C
100 μm cell strainer Falcon 6.05935
sterile forceps Bastos Viegas, SA 489-001
sterile scalpel Braun 5518059
Primaria cell cuture dish Falcon 353803
C-Chip Neubauer Improved Bioswisstech 505050
cell culture flask – Flask T300 TPP 90301
Equipment
Microbiological biosafety cabinet class II Skan 82011500
water bath Memmert 1305.0377
Stripettes Serological Pipette 5ml Corning 4487-200ea
microscope Olympus CKX41
humidified incubator Heracells 240 Thermo scientific 51026331
Heraeus Multifuge 1S-R Thermo scientific 75004331

References

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Cite This Article
Schlaefli, P., Bertolo, A., Malonzo, C., Poetzel, T., Baur, M., Steffen, F., Stoyanov, J. An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples. J. Vis. Exp. (98), e52694, doi:10.3791/52694 (2015).

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