Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays
Summary
Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
Abstract
Motilità superficie batterica, come sciamatura, è comunemente esaminato in laboratorio utilizzando saggi piastra che necessitano di specifiche concentrazioni di agar e talvolta inclusione di specifici nutrienti nel mezzo di crescita. La preparazione di tali mezzi espliciti e condizioni di crescita della superficie serve a fornire le condizioni favorevoli che permettano non solo la crescita batterica, ma la motilità coordinato di batteri su queste superfici all'interno film liquidi sottili. Riproducibilità della piastra sciame e altri test piastra motilità superficie può essere una grande sfida. Soprattutto di più "swarmers temperate", che mostrano la motilità solo all'interno di intervalli di agar di 0,4% -0,8% (peso / volume), piccole modifiche nel protocollo o ambiente di laboratorio può influenzare notevolmente i risultati del test sciame. "Bagnabilità", o contenuto di acqua all'interfaccia liquido-solido-aria di questi saggi piastra, è spesso una variabile chiave da controllare. Una sfida ulteriore per valutare sciamatura è come quantificare odifferenze bserved tra due (o più) esperimenti. Qui abbiamo i dettagli di un protocollo a due fasi versatile per preparare e saggi immagine sciame. Includiamo linee guida per aggirare le sfide comunemente associati con test sciame preparazione di terreni e la quantificazione dei dati da questi test. Abbiamo specificamente Dimostriamo il nostro metodo con batteri che esprimono reporter genetici fluorescenti o bioluminescenti come il verde proteina fluorescente (GFP), luciferasi (lux operon), o macchie cellulari per consentire imaging ottico time-lapse. Dimostriamo ulteriormente la capacità del nostro metodo per tenere traccia competere specie sciamare nella stessa sperimentazione.
Introduction
Molti batteri muovono su superfici con diversi mezzi di auto-propulsione. Alcuni fenotipi motilità possono essere ricercate in laboratorio utilizzando saggi targa che sono influenzati dall'ambiente liquido associato alla semi-solida composizione test piatto. Un sottogruppo di superficie utile test piastra motilità coinvolgere ulteriormente un aereo gas fase tipicamente stanza. Di conseguenza, il risultato di un particolare dosaggio motilità superficie, richiede un attento controllo dell'interfaccia di tre fasi: la superficie solida ambientale locale, ambiente liquido, e proprietà dell'ambiente gas.
La modalità motilità più comunemente studiato in tale dosaggio trifase è noto come brulicante. Swarming motilità è il movimento coordinato gruppo di cellule batteriche che sono spinto dalla loro flagelli attraverso film liquidi sottili su superfici 1. E 'tipicamente studiato nei laboratori utilizzando test piastra semi-solidi contenenti 0,4% -0,8% (peso / volume) agar 1. Una serie dipatogeni umani sfruttano questo comportamento motilità di esplorare e colonizzare l'ospite umano. Ad esempio, Proteus mirabilis utilizza brulicante motilità per spostare l'uretra, raggiungere e colonizzare la vescica e reni 2. Swarming motilità è generalmente considerato un passo precursore formazione di biofilm, la prima causa di patogenesi in molti patogeni umani 3.
Il fenotipo brulicante è molto varia tra le specie batteriche; successo sperimentale e riproducibilità fortemente basano su fattori quali la composizione nutritiva, agar tipo e composizione, protocollo di sterilizzazione (ad esempio, in autoclave), polimerizzazione supporti semi-solido, e umidità ambientale (ad esempio, variazioni stagionali), tra gli altri 3-5. La variabilità delle risposte motilità superficie sottolinea le sfide incontrate in questi studi e dei media influenza notevole e l'ambiente può esercitare. Per alcune specie brulicanti, come Pseudomonas, brulicante motility può verificarsi in una varietà di composizioni di media, anche se il fenotipo osservato e accompagnamento tasso di espansione sciame variano notevolmente 3. Insieme, questi fattori possono fare studi di motilità superficie estremamente impegnativo. La variabilità stagionale all'interno di un laboratorio in grado di influenzare questi test trifase: saggi possono funzionare meglio in umido con aria di estate e peggio in aria secca dell'inverno. Qui vi presentiamo le linee guida generali per aggirare alcune delle sfide più importanti quando si eseguono studi piastra motilità superficie.
Per alcuni studi motilità superficie, lo sviluppo di specifici fenotipi è di grande interesse. La maggior parte, ma non tutti, gli studi pubblicati per esaminare brulichio di P. aeruginosa mostrano la formazione di viticci o frattali irradiano da un centro di inoculazione 3-9. Differenze tra P. ceppi aeruginosa sono stati documentati 5,8, ma gran parte della presenza o assenza di viticci può essere attribuito alla specific medi e protocollo utilizzato per questi test piastra sciame motilità. Qui includiamo i dettagli su come promuovere sciami-viticcio formatura per P. aeruginosa. Poiché P. aeruginosa è solo uno dei tanti batteri brulicanti, includiamo anche i dettagli per il nostro metodo di esaminare brulichio di Bacillus subtilis e volo a vela di Myxococcus Xanto. Come P. aeruginosa, ricerca attuale in B. subtilis e M. Xanto si estende su una vasta gamma di argomenti, come i ricercatori stanno lavorando a discernere gli aspetti della sporulazione, motilità, la risposta allo stress, e il comportamento di transizione 1,10. Vi è la necessità di quantificare gli schemi e le dinamiche del comportamento specifico (s) per queste cellule in gruppi che sciamano.
Acquisizione dati motilità superficiale, analisi e interpretazione può essere ingombrante e qualitativa. Abbiamo sviluppato un protocollo per l'analisi macroscopica dettagliata di sciami batteriche che fornisce oltre a sciamare zona morfologia e size (ad esempio, di diametro), informazioni dinamiche quantitative riguardanti tasso di espansione sciame e batterica o la densità di distribuzione bioproduct 7. Inoltre, questo metodo può usufruire di proteine disponibili fluorescenti, luminescenza e coloranti per ottenere una visione completa delle interazioni batteriche 8, nonché per monitorare la sintesi di bioprodotti (ad esempio, P. aeruginosa rhamnolipid 7,8) all'interno di uno sciame.
Protocol
Representative Results
Discussion
Raggiungere sciamatura riproducibile in laboratorio può essere impegnativo, come saggi sciami sono molto sensibili a fattori ambientali, come l'umidità e le sostanze nutrienti disponibili. L'aspetto più critico di una superficie dosaggio piastra motilità è umidità sulla superficie di agar. Prima di inoculazione, i media sciame deve essere sufficientemente asciutto per evitare le cellule batteriche dal nuoto attraverso il liquido di superficie, ma non così secco da inibire brulicante motilità 5. L'incubazione deve avvenire in un ambiente sufficientemente umido: troppo poca umidità può causare il test essiccazione durante l'incubazione, mentre troppa umidità può portare a superficie artificiale o artefatta diffusione. A meno che un incubatore umidità controllata è a portata di mano, incubatore e laboratorio di umidità può variare notevolmente. Di conseguenza, un serbatoio supplementare di acqua, un umidificatore o un deumidificatore nella incubatore potrebbero essere necessarie per prevenire l'essiccazione o sopra l'accumulo di umidità in eccesso mantenendo la relative umidità vicino all'80%. Il mantenimento di tale umidità ideale può risultare difficile se i cambiamenti di umidità stagionali sono significative. Se questo è il caso, il protocollo test sciame richiederà alcuni adeguamenti per tener conto delle variazioni stagionali di umidità. Abbiamo scoperto che modificando il tempo di supporto sciame di essiccazione è il modo più semplice per regolare per variazioni di umidità stagionali. Monitoraggio di umidità costante, sia all'interno che all'esterno dell'incubatrice, è raccomandato. Inoltre, si raccomanda che i ricercatori calibrare e validare i loro strumenti, incubatori, bilance, ecc errori come minori di temperatura, volume o quantità di componenti multimediali possono influire riproducibilità di questi test.
Va inoltre osservato che il tipo e le dimensioni della piastra usato nel saggio possono influenzare piastra umidità, e pertanto brulicante. Piastre ermetica Non sfogare fuori l'umidità in eccesso, incoraggiando così il nuoto motilità. Al contrario, le piastre a doppia facciata permettono troppa umidità a fuggire. Un piatto di Petrifornisce un ambiente ideale perché sfoga fuori abbastanza umidità in eccesso per evitare l'accumulo di liquidi, ma mantiene abbastanza umidità per evitare che il supporto si secchi. Questo metodo dettagli di un protocollo test motilità superficie che permette l'imaging di alta qualità. Per mantenere l'agar chiara per l'imaging 60 millimetri Ø piatti sono pieni di 7,5 ml di agar. Se non è richiesto l'imaging dettagliato, i volumi fino a 20 ml possono anche fornire risultati riproducibili.
Mentre brulicante motilità può essere realizzato su una vasta gamma di concentrazioni di agar, la gamma ottimale di agar necessaria per sciamare dipende dalla specie. Nel complesso, le concentrazioni più elevate di agar inibiscono brulicante motilità, e di conseguenza il tempo necessario per produrre un'immagine-ready sciame aumenta. P. aeruginosa generalmente sciami sulle concentrazioni agar tra 0,4-0,7% 1, ma troviamo che sciamare ottimale si verifica in un range molto ristretto (0,4-0,5%). Altri, come B. subtilis e S. entericouno sciame al 0,6% agar, e Vibrio parahaemolyticus al 1,5% agar 10. La concentrazione di agar necessaria viene determinata anche dal tipo e marca di agar. Superiori agar purezza, come agar Noble, aumentano fortemente brulicante in P. aeruginosa e sono preferite rispetto granulato agar 13,14. Tuttavia, queste versioni purificati di agar sono anche più inclini a caramellizzazione durante il ciclo di sterilizzazione in autoclave; a seconda dello strumento, un / sequenza di sterilizzazione modificato ridotto (per modificare, eventualmente, il ciclo di scarico per evitare l'esposizione al calore prolungato) può essere richiesto per preparare supporti sciame con agar Noble.
Composizione media svolge anche un ruolo nel sciame fenotipo osservata 3. P. aeruginosa studi brulicante motilità sono di solito eseguite con terreni di coltura minimo. Preferiamo FAB medio 4,8 (Materials Table), ma anche altri media, come M9, LB, o leggere variazioni a questi mezzi comuni,sono stati utilizzati con successo 9,15,16. Formazione Tendril migliore avviene nelle FAB terreno minimo addizionato con glucosio come fonte di carbonio e acidi Casamino (CAA), ma senza una fonte di azoto addizionale (cioè, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. Se la formazione viticcio o la morfologia non è l'obiettivo principale dello studio, quindi FAB terreno minimo (Materiali tabella; Tabella 1) priva di CAA si raccomanda in modo che gli effetti di fonti di carbonio specifici e / o sostanze nutrienti supplementari possono essere studiati in dettaglio. Altre specie, come B. subtilis (presentato qui), sono swarmers versatili, capaci di sciamare su LB e agar granulato. Queste specie sciame facilmente, richiede solo ~ 10 ore per sviluppare uno sciame completo. Questo rapido tasso brulicante fa seguito alla progressione dello sciame potenzialmente difficile, ma il nostro protocollo rende tale monitoraggio molto fattibile. La possibilità di eseguire sciame time-lapse imaging fornisce un sostanziale facilità di acquisizione dati sciame, in particolare da tali sciami accaniti.
Introduciamo un robusto, completo, protocollo a due fasi e le linee guida volte a migliorare l'esecuzione e la riproducibilità di batteri ricerche motilità superficie ed abbiamo soprattutto sottolineato gli aspetti importanti per esaminare sciamatura flagellare-mediata. Dettagli Questo protocollo test sciame aspetti importanti della composizione e la movimentazione delle lastre motilità superficie media per garantire una maggiore coerenza e riproducibilità all'interno e tra gruppi di ricerca. Ciò permetterà di migliorare la base di confronto tra i diversi studi di ricerca. Inoltre, l'approccio presentato e protocollo prevede mezzi per fare ricerca sulla brulicante e di superficie motilità meno sensibili alle variazioni ambientali, rendendo ricercatori consapevoli che tali fattori influenzano il loro lavoro e fornire possibili soluzioni (ad esempio, come piccoli cambiamenti nella agar influiscono brulicante 4,5 ). Inoltre, il protocollo fornitoquantificare aspetti macroscopici di sciamare, offre la possibilità di misurare molti attributi di crescita superficie batterica che erano in precedenza quantificabile.
Non abbiamo esaminato tutti i batteri mobili di superficie per lo sviluppo di questo protocollo. Come tale, si prevede che modifiche protocollo saranno necessari per specie non qui presentati. L'efficienza di questo protocollo è limitata dai limiti intrinseci delle apparecchiature e dei materiali impiegati. Per esempio, gli studi relativi alla temperatura non sono possibili ancora con la stazione di imaging Bruker, poiché il controllo della temperatura non è una caratteristica dell'apparecchiatura. Inoltre, l'uso di coloranti (ad esempio Nilo Red macchiare rhamnolipids) può avere limitazioni cinetiche e concentrazione 8. Questa tecnica si basa fortemente sul trattamento e analisi di immagini digitali; migliore automazione dell'analisi di dati (ad esempio, usando macro supplementari funzione di script in ImageJ) sarebbe ridurre il tempo necessario per l'analisied espandere l'utilità dei dati. Infine, a causa della robustezza del protocollo di imaging, le applicazioni future devono mirare ad espandere questa tecnica per esaminare le superfici di crescita meno uniformi che sono più rilevanti per le superfici colonizzate dai batteri ambientali e patogeni.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supporto parziale per questo lavoro è stato fornito dal National Institute of Health (R01GM100470 e 1R01GM095959-01A1, per MA e JDS) e un sussidio Core strumento dalla Indiana clinica e traslazionale Sciences Institute (finanziato in parte dal NIH concedere # UL1 TR000006; a JDS).
Materials
| Materials table | ||||
| Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
| Reagentsa: | ||||
| FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
| Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
| NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
| MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
| CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
| Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
| Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
| CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
| MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
| CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
| ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
| CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
| NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
| H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
| FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
| CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
| Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
| K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
| MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
| Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
| Additional Reagents: | ||||
| LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
| Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
| Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
| SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
| Relevant Materials and Equipment: | ||||
| Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
| Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
| Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
| In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
| Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
| ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. | ||||
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