הכנה, הדמיה, וכימות של מבחני תנועתיות Surface בקטריאלי
Summary
Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
Abstract
תנועתיות משטח חיידקים, כגון רץ, נבחנה בדרך כלל במעבדה באמצעות מבחני צלחת שמחייבים ריכוז מסוים של אגר ולפעמים הכללה של חומרים מזינים מסוימים במדיום הגידול. עריכת כגון המדיה מפורשת ותנאי גידול המשטח משמשת לתת לתנאים המועדפים שמאפשרים לא רק התפתחות חיידקים אבל תנועתיות מתואמת של חיידקים מעל המשטחים אלה בתוך נוזל בסרטים דקים. שחזור של צלחת נחיל ומבחני צלחת תנועתיות משטח אחרים יכול להיות אתגר מרכזי. במיוחד עבור "swarmers הממוזג" יותר שמפגין תנועתיות רק בטווח אגר של 0.4% -0.8% (wt / כרך), שינויים קלים בפרוטוקול או בסביבת מעבדה יכולה להשפיע על תוצאות assay נחיל מאוד. "יכולת רטיבות", או תכולת מים בממשק נוזל-מוצק-האוויר של מבחני צלחת אלה, היא לעתים קרובות משתנים מפתח להיות בשליטה. אתגר נוסף בהערכת הרץ הוא איך לכמת oהבדלים בין כל שני bserved ניסויים (או יותר). כאן אנו פירוט פרוטוקול שני שלבים תכליתיים להכין ואת מבחני נחיל תמונה. אנו כוללים הנחיות לעקוף את האתגרים הקשורים בדרך כלל עם הכנת תקשורת assay הנחיל וכימות של נתונים ממבחנים אלה. אנחנו במיוחד להדגים את השיטה שלנו באמצעות חיידקים המבטאים כתבים גנטיים ניאון או bioluminescent כמו, לוציפראז (operon סוויטה דה לוקס) חלבון פלואורסצנטי (GFP) הירוק, או כתמים סלולריים כדי לאפשר הדמיה אופטית זמן לשגות. בנוסף, אנו מראים את היכולת של השיטה שלנו כדי לעקוב אחר מתחרים מינים שורצים באותו הניסוי.
Introduction
חיידקים רבים לעבור על משטחים תוך שימוש באמצעים שונים של הנעה עצמית. אפשר לחקור פנוטיפים תנועתיות מסוימים במעבדה באמצעות מבחני צלחת שמושפעים מהסביבה הנוזלית הקשורים להרכב assay צלחת חצי מוצק. תת-קבוצה של מבחני צלחת תנועתיות משטח שימושי נוספת כרוכה בגז שלב-כלל באוויר חדר. בהתאם לכך, את התוצאה של כל assay תנועתיות משטח מסוים, דורשת שליטה קפדנית של הממשק של שלושה שלבים: המשטח המוצק הסביבתי המקומי, סביבה נוזלית, ואת מאפייני סביבת גז.
מצב תנועתיות הנפוצה ביותר למד בassay כגון שלושה שלבים ידוע כשורץ. שורץ תנועתיות היא תנועת הקבוצה מתואמת של תאי חיידקים המונעים על ידי שוטונים שלהם באמצעות סרטי נוזל דקים על משטחי 1. הוא למד בדרך כלל במעבדות באמצעות מבחני צלחת חצי מוצקים המכילים 0.4% -0.8% (wt / כרך) אגר 1. מערך שלפתוגנים אנושיים לנצל זאת תנועתיות התנהגות לחקור וליישב את המארח האנושי. לדוגמא, מיראביליס פרוטאוס משתמש רוחש תנועתיות לעלות השופכה, להגיע ומיישבי שלפוחית השתן וכליות 2. תנועתיות רוחשות נחשבות בדרך כלל שלב מקדים להיווצרות biofilm, הגורם העיקרי להיווצרות מחלה בפתוגנים אנושיים רבים 3.
פנוטיפ הרוחשים הוא מגוון מאוד בין מיני חיידקים; הצלחה ושחזור ניסיוני מאוד לסמוך על גורמים כגון הרכב תזונתי, סוג אגר והרכב, פרוטוקול עיקור (למשל, מעוקר), ריפוי תקשורת חצי מוצק, ולחות סביבה (למשל, שינויים עונתיים), בין יתר 3-5. ההשתנות של תגובות תנועתיות משטח מדגישה את האתגרים נתקלו במחקרים הללו והתקשורתיים השפעה המהותית והסביבה יכול תפעיל. לכמה מינים רוחשים, כמו Pseudomonas, mot שורץility יכול להתרחש במגוון של יצירות תקשורת, אם כי הפנוטיפ הנצפה וקצב התפשטות נחילי נלווה ישתנו מאוד 3. , גורמים בשילוב אלה יכולים להפוך את לימודי תנועתיות משטח מאתגרים מאוד. שינויים עונתיים במעבדה יכולים להשפיע על מבחני שלושת שלבים הבאים: מבחני עשויים לתפקד טובים יותר בלח-האוויר של הקיץ וגרוע באוויר היבש של החורף. כאן אנו מציגים הנחיות כלליות לעקוף כמה מהאתגרים הבולטים ביותר בעת ביצוע מחקרי צלחת תנועתיות פני השטח.
לחלק ממחקרי תנועתיות פני השטח, הפיתוח של פנוטיפים מסוימים הוא עניין רב. רוב אך לא כולם, מחקרים, שפורסמו לבחון רחש של P. aeruginosa להראות את היווצרות קנוקנות או פרקטלים קורנים ממרכז חיסון 3-9. הבדלים בין פ זני aeruginosa תועדו 5,8, אבל הרבה של הנוכחות או עדר של קנוקנות ניתן לייחס הספציפימדיום ג ופרוטוקול המשמשים למבחני צלחת תנועתיות נחיל אלה. כאן אנו כוללים פרטים על איך לקדם את נחילי יוצרי זלזל לפ aeruginosa. בגלל P. aeruginosa הוא רק אחד של חיידקים שורצים רבים, אנחנו כוללים גם פרטים על השיטה שלנו לבחון רץ של Bacillus subtilis וגלישה של xanthus Myxococcus. כמו P. aeruginosa, מחקר נוכחי בB. subtilis ומ ' xanthus משתרע על פני מגוון נושאים כמו חוקרים פועל כדי להבחין באספקטים של נִבִיגָה, תנועתיות, תגובת לחץ, והתנהגות 1,10 מעבר. יש צורך לכמת את הדפוסים ודינמיקה של ההתנהגות הספציפית (ות) עבור תאים אלה בקבוצות רוחשות.
רכישת נתונים תנועתיות פני השטח, ניתוח, ופרשנות יכולה להיות מסורבלת ואיכותית. פיתחנו פרוטוקול לניתוח מקרוסקופית מפורט של נחילי חיידקים המספק בנוסף לנחילי מורפולוגיה אזור ושלize (קוטר למשל,), מידע דינמי כמותי לגבי קצב התפשטות נחיל והפצת חיידקים או צפיפות bioproduct 7. יתר על כן, שיטה זו יכולה לנצל את חלבונים זמינים ניאון, הארה, וצבעים כדי להשיג מבט מקיף של אינטראקציות חיידקים 8, כמו גם לעקוב אחר הסינתזה של bioproducts (למשל, P. aeruginosa rhamnolipid 7,8) בתוך נחיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
השגת רץ לשחזור במעבדה יכולה להיות מאתגר, כמו מבחני נחיל רגישים מאוד לגורמים סביבתיים, כגון לחות וחומרים מזינים זמינים. ההיבט הקריטי ביותר של assay צלחת תנועתיות פני השטח הוא לחות על פני השטח אגר. לפני החיסון, תקשורת נחיל חייבת להיות יבשה מספיק כדי למנוע מתאי חיידקים שחיה על פני נוזל פני השטח, אבל לא כל כך יבשה כמו לעכב רוחש תנועתיות 5. דגירה צריכה להתבצע בסביבה מספיק לחה: לחות מעט מדי יכולה לגרום להתייבשות assay במהלך דגירה, בעוד לחות רבה מדי יכולה להוביל למשטח מלאכותי או artifactual מתפשט. אלא אם כן חממת לחות מבוקרת היא בהישג היד, לחות חממה והמעבדה יכולה להשתנות באופן דרמטי. כתוצאה מכך, מאגר מים נוסף, מכשיר אדים, או מסיר לחות בחממה ייתכן שיידרש כדי למנוע מעל ייבוש או ההצטברות של עודף לחות, תוך שמירה על relatלחות ive קרוב 80%. שמירה על לחות אידיאלית זה עשויה להוכיח מאתגר אם שינויי לחות עונתיות משמעותיים. אם זה המקרה, פרוטוקול assay הנחיל ידרוש קצת התאמות לחשבון לשינויים עונתיים בלחות. מצאנו כי שינוי זמן ייבוש תקשורת הנחיל הוא הדרך הפשוטה ביותר כדי להתאים לשינויי לחות עונתיים. ניטור לחות קבוע, הן בתוך ומחוץ לחממה, מומלץ. יתר על כן, מומלץ שהחוקרים לכייל ולאמת המכשירים, החממות, הקשקשים שלהם, וכו 'טעויות קטנות כמו בטמפרטורה, נפח או סכומם של רכיבי תקשורת יכול להשפיע שחזור של מבחני אלה.
צריך גם לציין שאת הסוג והגודל של הצלחת המשמש assay יכולים להשפיע על לחות צלחת, ובכך רוחש. צלחות אטום לא לפרוק את עודף לחות, ובכך תנועתיות השחייה מעודדת. בניגוד לכך, צלחות פתוחות פנים לאפשר יותר מדי לחות לברוח. צלחת פטרימספק סביבה אידיאלית כי זה פתחי אוורור מעודף לחות מספיק כדי למנוע נוזל לבנות, אבל שומר על לחות מספיק כדי למנוע את התקשורת מהתייבשות. שיטה זו מפרטת פרוטוקול assay תנועתיות משטח המאפשר הדמיה באיכות גבוהה. כדי לשמור על אגר ברור לכלים בקוטר 60 מ"מ הדמיה מלא 7.5 מיליליטר של תקשורת אגר. אם אינה נדרשת הדמיה מפורטת, כרכים עד 20 מיליליטר יכולים גם לספק תוצאות לשחזור.
בעוד תנועתיות רוחשת ניתן להשיג במגוון רחב של ריכוזים אגר, הטווח האופטימלי של אגר הנדרשים לרץ תלוי במין. בסך הכל, ריכוזים גבוהים יותר אגר אינם מאפשרים תנועתיות רוחשת, וכתוצאה מכך את הזמן הדרוש כדי לייצר עליות נחיל דימוי מוכן. P. aeruginosa בדרך כלל שורץ בריכוזים אגר בין .4-.7 1%, עם זאת אנו מוצאים כי רץ אופטימלי מתרחש בטווח צר הרבה יותר (0.4-0.5%). אחרים, כגון B. subtilis וS. entericנחיל באגר 0.6%, וparahaemolyticus Vibrio בשיעור של 1.5% אגר 10. הריכוז אגר הנדרש נקבע גם על ידי הסוג והמותג של אגר. agars טוהר גבוה יותר, כמו אגר נובל, מאוד לשפר שורץ בפ aeruginosa ועדיף על מגורען אגר 13,14. עם זאת, גרסאות אלה מטוהרות של אגר הם גם נוטים יותר לשזופים במהלך מחזור עיקור החיטוי; תלוי במכשיר, רצף מקוצר / שונה עיקור (לאולי לשנות את מחזור הפליטה כדי למנוע חשיפה לחום ממושך) עשוי להידרש להכין תקשורת נחיל באמצעות אגר נובל.
הרכב תקשורת גם משחק תפקיד בפנוטיפ הנחיל נצפה 3. P. מחקרי תנועתיות רוחשת aeruginosa מבוצעים בדרך כלל באמצעות מדיה תזונתית מינימאלית. אנחנו מעדיפים FAB 4,8 בינוני (לוח חומרים), אך כלי תקשורת אחרות, כגון M9, LB, או שינויים קלים לתקשורת הנפוצה אלה,שימש בהצלחה 9,15,16. היווצרות זלזל היא הטובה ביותר להשיג על מדיום המינימלי FAB בתוספת גלוקוז כמקור פחמן וחומצות casamino (CAA), אך ללא מקור חנקן נוסף (כלומר, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. אם היווצרות זלזל או מורפולוגיה היא לא המוקד העיקרי של המחקר, ולאחר מכן בינוני מינימאלי FAB (לוח חומרים; טבלת 1) נטול CAA מומלץ כך שההשפעות של מקורות ספציפיים פחמן ו / או חומרים מזינים נוספים ניתן ללמוד בפירוט. מינים אחרים, כגון B. subtilis (המוצג כאן), הוא swarmers תכליתי, מסוגל שורץ על LB ואגר מגורענים. מינים אלה נחילים בקלות, הדורשים רק ~ 10 שעות כדי לפתח נחיל מלא. שיעור מהיר רוחש זה עושה הבא התקדמות הנחיל קשה שעלולים להיות אבל הפרוטוקול שלנו עושה כזה מעקב מאוד ריאלי. היכולת לבצע הדמיה הזמן לשגות נחיל מספקת substantial להקל ברכישת נתונים נחיל, במיוחד מswarmers נלהב כזה.
אנחנו מציגים,, פרוטוקול חזק מקיף שני שלבים והנחיות שמטרתן שיפור הביצוע והשחזור של מחקר תנועתיות משטח חיידקים והדגשנו בעיקר היבטים חשובים לבחון רץ בתיווך flagellar. פרוטוקול assay נחיל זה מפרט היבטים חשובים של הרכב תקשורת וטיפול בצלחות תנועתיות פני השטח כדי לספק לעקביות רבה יותר ושחזור בתוך ובין קבוצות מחקר. זה ישפר את בסיס השוואה בין מחקרים שונים. בנוסף, הגישה והפרוטוקול שהוצגה מספק אמצעים לעשות מחקר על תנועתיות רץ ומשטח פחות רגיש לשינויים סביבתיים על ידי הפיכת חוקרים מודעים לכך שגורמים כגון להשפיע על עבודתם ומתן פתרונות אפשריים (למשל, כיצד שינויים קטנים באגרו להשפיע רוחש 4,5 ). יתר על כן, הפרוטוקול הניתן ללכמת היבטים מקרוסקופית של רץ, מספק הזדמנות למדידת תכונות רבות של צמיחת משטח חיידקים שהיו בלתי ניתנים למדידה בעבר.
לא בדקנו את כל חיידקי ניע המשטח בפיתוח של פרוטוקול זה. ככזה, הוא צפוי כי שינויי פרוטוקול יידרשו למינים אינם מוצגים כאן. היעילות של פרוטוקול זה מוגבל על ידי הגבולות הגלומים של הציוד וחומרים מועסקים. לדוגמא, מחקרים הקשורים טמפרטורה אינם אפשריים עדיין עם תחנת ההדמיה הברוקר, מאז בקרת טמפרטורה היא לא תכונה של הציוד. בנוסף, השימוש בצבעים (כגון הנילוס אדום להכתים rhamnolipids) יכול להיות מגבלות הקינטית וריכוז 8. טכניקה זו מאוד מסתמכת על העיבוד והניתוח של תמונות דיגיטליות; אוטומציה משופרת של ניתוח נתונים (לדוגמא, באמצעות פקודות מאקרו נוספות פונקצית תסריט בImageJ) היה להפחית את הזמן הנדרש לניתוחולהרחיב את השימושיות של הנתונים. לבסוף, בשל חוסנו של פרוטוקול ההדמיה, יישומים עתידיים צריכים לשאוף בהרחבה בטכניקה זו כדי לבחון משטחי צמיחה פחות אחידים שרלוונטיים יותר למשטחים יישבו על ידי חיידקים פתוגניים וסביבתיים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה חלקית עבור עבודה זו סופקה על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01GM100470 ו1R01GM095959-01A1; לתואר שני וJDS) ומענק מתקן Core מהמדעים קליניים וTranslational מכון אינדיאנה (מומן בחלקו על ידי מענק # NIH UL1 TR000006; ל JDS).
Materials
| Materials table | ||||
| Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
| Reagentsa: | ||||
| FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
| Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
| NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
| MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
| CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
| Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
| Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
| CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
| MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
| CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
| ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
| CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
| NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
| H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
| FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
| CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
| Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
| K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
| MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
| Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
| Additional Reagents: | ||||
| LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
| Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
| Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
| SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
| Relevant Materials and Equipment: | ||||
| Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
| Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
| Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
| In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
| Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
| ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. | ||||
References
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews: Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Burall, L. S., et al. et al.Proteus mirabilis. genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: Identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infection and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa. biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PLoS One. 6 (6), e20888 (2011).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa. swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M., O’Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Du, H., et al. High density waves of the bacterium Pseudomonas aeruginosa. in propagating swarms result in efficient colonization of surfaces. Biophysical Journal. 103 (3), 601-609 (2012).
- Morris, J. D., et al. Imaging and analysis of Pseudomonas aeruginosa. swarming and rhamnolipid production. Appl Environ Microbiol. 77 (23), 8310-8317 (2011).
- Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa. swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. J Bacteriol. 195 (5), 909-918 (2013).
- Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis .do not exhibit swarming motility. Journal of Bacteriology. 191 (22), 7129-7133 (2009).
- . . Molecular Imaging. , (2014).
- Harshey, R. M., Matsuyama, T. Dimorphic transition in Escherichia coli. and Salmonella typhimurium.: surface-induced differentiation into hyperflagellate swarmer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 91 (18), 8631-8635 (1994).
- Rashid, M. H., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa. Proc Nat Acad Sci U.S.A.. 97 (9), 4885-4890 (2000).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O’Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa. PA14. Journal of Bacteriology. 189 (9), 3603-3612 (2007).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic-di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa.: the pilY1. gene and its impact on surface-associated behaviors. J Bacteriol. 192 (12), 2950-2964 (2010).
