Préparation, imagerie, et la quantification de la surface bactérienne motilité dosages
Summary
Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
Abstract
La motilité de surface bactériennes, telles que l'essaimage, est couramment examinée dans le laboratoire en utilisant des dosages de plaques qui nécessitent des concentrations spécifiques de gélose et parfois inclusion de nutriments spécifiques dans le milieu de croissance. La préparation de ces milieux explicites et les conditions de croissance de la surface sert à fournir les conditions favorables qui permettent la croissance bactérienne, mais pas seulement la motilité coordonnée de bactéries sur ces surfaces à l'intérieur films liquides minces. Reproductibilité de la plaque d'essaim et d'autres essais sur plaque de la motilité de surface peut être un défi majeur. Surtout pour les plus "swarmers tempérées" qui présentent la motilité seulement dans des plages de gélose de 0,4% -0,8% (poids / vol), de modifications mineures dans le protocole ou l'environnement de laboratoire peut grandement influencer les résultats d'analyse de l'essaim. "Mouillabilité", ou la teneur en eau à l'interface liquide-solide-air de ces essais sur plaque, est souvent une variable clé à contrôler. Un défi supplémentaire dans l'évaluation de l'essaimage est comment quantifier observed différences entre deux (ou plusieurs) des expériences. Ici, nous en détail un protocole polyvalent en deux phases pour préparer et analyses d'image essaim. Nous incluons des lignes directrices pour contourner les difficultés généralement associées à dosage essaim préparation des milieux et la quantification des données de ces essais. Nous démontrons spécifiquement notre méthode en utilisant des bactéries qui expriment journalistes génétiques fluorescentes ou bioluminescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP), la luciférase (lux opéron), ou des taches cellulaires pour permettre l'imagerie optique time-lapse. Nous démontrons encore la capacité de notre méthode pour suivre les espèces essaimage concurrence dans la même expérience.
Introduction
De nombreuses bactéries se déplacent sur des surfaces en utilisant divers moyens d'auto-propulsion. Des phénotypes de motilité peuvent être recherchés dans le laboratoire en utilisant des dosages de plaques qui sont affectées par l'environnement liquide associé à la composition de dosage de plaque semi-solide. Un sous-ensemble de la surface utile essais sur plaque de motilité implique en outre un air en phase gazeuse, généralement chambre. En conséquence, le résultat de tout essai de motilité de surface particulier, exige un contrôle minutieux de l'interface de trois phases: la surface solide de l'environnement locale, de l'environnement, liquide et propriétés de l'environnement de gaz.
Le mode de motilité plus couramment étudié dans un tel essai triphasé est connue comme l'essaimage. Essaimage motilité est le mouvement coordonné de groupe de cellules bactériennes qui sont propulsés par leurs flagelles par des films minces sur des surfaces liquides 1. Il est généralement étudiée dans des laboratoires utilisant des dosages de plaques semi-solides contenant 0,4% -0,8% (poids / volume) d'agar 1. Un tableau deagents pathogènes humains exploitent cette motilité comportement d'explorer et de coloniser l'hôte humain. Par exemple, Proteus mirabilis utilise essaimage motilité se déplacer jusqu'à l'urètre, d'atteindre et de la colonisation de la vessie et les reins 2. Motilité essaimage est généralement considéré comme une étape de précurseur de la formation de biofilm, la principale cause de la pathogenèse dans de nombreux agents pathogènes humains 3.
Le phénotype essaimage est très varié parmi les espèces bactériennes; le succès et la reproductibilité expérimentale se appuient fortement sur des facteurs tels que la composition en éléments nutritifs, le type et la composition de la gélose, le protocole de stérilisation (par exemple, autoclavage), semi-solide durcissement des médias, et de l'humidité ambiante (par exemple, les changements saisonniers), entre autres 3-5. La variabilité des réponses de la motilité de surface souligne les difficultés rencontrées dans ces études et les médias d'influence notable et environnement peuvent exercer. Pour certaines espèces, grouillant comme Pseudomonas, mot essaimageilité peut se produire sur une variété de compositions de presse, bien que le phénotype observé et accompagnant taux d'expansion de l'essaim peuvent varier grandement 3. Ensemble, ces facteurs peuvent faire des études de la motilité de surface extrêmement difficile. La variabilité saisonnière dans un laboratoire peut influencer ces essais en trois phases: tests peuvent mieux fonctionner dans l'air humide de l'été et pire dans l'air sec de l'hiver. Nous présentons ici des lignes directrices générales pour contourner certains des défis les plus remarquables lors de la réalisation des études de la plaque de la motilité de surface.
Pour certaines études de motilité de surface, le développement de phénotypes spécifiques est d'un grand intérêt. La plupart, mais pas tous, les études publiées à examiner essaimage de P. aeruginosa correspond à la formation de vrilles ou fractales rayonnant à partir d'un centre d'inoculation 9.3. Différences entre P. souches aeruginosa ont été documentés 5,8, mais une grande partie de la présence ou l'absence de vrilles peuvent être attribué au spécifimilieu de c et le protocole utilisés pour ces essais sur plaque essaim de la motilité. Ici, nous inclure des détails sur la façon de promouvoir essaims de vrille formation pour P. aeruginosa. Parce que P. aeruginosa est juste une des nombreuses bactéries essaimage, nous incluons aussi les détails de notre méthode pour examiner l'essaimage de Bacillus subtilis et de glisse des Myxococcus xanthus. Comme P. aeruginosa, la recherche actuelle sur B. subtilis et M. xanthus couvre un éventail de sujets que les chercheurs travaillent à discerner les aspects de la sporulation, la motilité, la réponse au stress, et le comportement transitoire 1,10. Il est nécessaire de quantifier les caractéristiques et la dynamique du comportement (s) spécifique de ces cellules dans des groupes essaimage.
acquisition de données de la motilité de surface, l'analyse et l'interprétation peut être lourd et qualitative. Nous avons élaboré un protocole pour l'analyse macroscopique détaillée des essaims bactériennes qui fournit en plus à essaimer zone morphologie et sIze (par exemple, de diamètre), des informations dynamiques quantitatives concernant le taux d'expansion de la nuée et de la distribution ou de la densité bactérienne de bioproduits 7. En outre, cette méthode peut profiter de protéines fluorescentes disponibles, la luminescence, et des colorants pour obtenir une vue complète des interactions bactériennes 8, ainsi que de suivre la synthèse des bioproduits (par exemple, P. aeruginosa rhamnolipide 7,8) dans un essaim.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atteindre essaimage reproductible dans un laboratoire peut être difficile, que des tests d'essaims sont très sensibles à des facteurs environnementaux, tels que l'humidité et les éléments nutritifs disponibles. L'aspect le plus critique d'un essai sur plaque de la motilité de surface est l'humidité sur la surface de la gélose. Avant l'inoculation, les médias d'essaims doivent être suffisamment sec pour empêcher les cellules bactériennes de la natation à travers le liquide de surface, mais pas si sec que pour inhiber la motilité 5 essaimage. L'incubation devrait avoir lieu dans un environnement suffisamment humide: trop peu d'humidité peut entraîner dans le dosage dessèchement pendant l'incubation, alors que trop d'humidité peut conduire à la diffusion de surface artificielle, soit un artéfact. Sauf un incubateur à humidité contrôlée est à portée de main, incubateur et laboratoire d'humidité peut varier considérablement. Par conséquent, un réservoir d'eau supplémentaire, un humidificateur, un déshumidificateur ou à l'intérieur de l'incubateur peuvent être nécessaires pour éviter un séchage excessif ou l'accumulation de l'excès d'humidité tout en maintenant la relative humidité près de 80%. Le maintien de ce taux d'humidité idéal peut se avérer difficile si des changements d'humidité saisonniers sont importants. Si ce est le cas, le protocole de dosage essaim exigera certains ajustements pour tenir compte des variations saisonnières de l'humidité. Nous avons trouvé que la modification du temps de séchage des médias essaim est la façon la plus simple pour ajuster les changements d'humidité saisonniers. Contrôle de l'humidité constante, à l'intérieur et à l'extérieur de l'incubateur, est recommandée. En outre, il est recommandé que les chercheurs calibrer et valider leurs instruments, des incubateurs, des échelles, etc. erreurs comme mineures dans la température, le volume ou quantités de composants de médias peuvent avoir un impact reproductibilité de ces essais.
Il convient également de noter que le type et la taille de la plaque utilisée dans le dosage peuvent affecter plaque humidité, et donc l'essaimage. Plaques hermétique Ne pas évacuer l'excès d'humidité, ainsi piscine encourageants motilité. En revanche, les plaques ouvertes face permettent trop d'humidité de se échapper. Une boîte de Pétrifournit un environnement idéal car il évacue l'excès d'humidité assez large pour empêcher le liquide se accumuler, mais conserve suffisamment d'humidité pour empêcher les médias de se dessécher. Cette méthode détaille un protocole de dosage de la motilité de surface qui permet la formation d'image de haute qualité. Pour garder l'agar clair pour les plats imagerie 60 mm de diamètre sont remplis avec 7,5 ml de milieu agar. Si l'imagerie détaillée ne est pas nécessaire, le volume jusqu'à 20 ml peuvent également fournir des résultats reproductibles.
Alors que la motilité essaimage peut être réalisé sur un large éventail de concentrations de gélose, la plage optimale d'agar requis pour essaimage dépend de l'espèce. Dans l'ensemble, les concentrations de gélose élevés inhibent la motilité essaimage, et par conséquent le temps nécessaire pour produire un essaim augmentations d'image prêt. P. aeruginosa grouille généralement sur les concentrations de gélose entre 0,4-0,7% 1, mais nous constatons que l'essaimage optimale se produit dans une gamme beaucoup plus étroite (0,4 à 0,5% de). D'autres, comme B. subtilis et S. entériqueun essaim à 0,6% d'agar, et Vibrio parahaemolyticus à 1,5% d'agar 10. La concentration nécessaire agar est également déterminée par le type et la marque d'agar. Géloses de pureté plus élevée, comme l'agar Noble, améliorer fortement pullulent dans les P. aeruginosa et on préfère plus granulé agar 13,14. Toutefois, ces versions purifiées de gélose sont également plus susceptibles de caramélisation pendant le cycle de stérilisation en autoclave; en fonction de l'instrument, une séquence raccourci / modifiées de stérilisation (pour modifier éventuellement le cycle d'échappement pour éviter toute exposition prolongée à la chaleur) peut être nécessaire pour préparer les médias essaim utilisant agar Noble.
Composition de médias jouent également un rôle dans l'essaim phénotype observé trois. P. aeruginosa études de motilité essaimage sont généralement effectuées à l'aide des milieux nutritifs minimaux. Nous préférons FAB moyenne 4,8 (tableau des matériaux), mais d'autres médias, tels que M9, LB, ou de légères variations à ces médias communs,ont été utilisés avec succès 9,15,16. Formation vrille est mieux réalisée sur FAB milieu minimum complété avec du glucose comme source de carbone et d'hydrolysat acide de caséine (CAA), mais sans source d'azote supplémentaire (ce est-(NH 4) 2 SO 4) 6,13. Si la formation de vrille ou la morphologie ne est pas l'objectif principal de l'étude, puis FAB milieu minimal (tableau Matériaux; Tableau 1) dépourvu de CAA est recommandé de sorte que les effets des sources de carbone spécifiques et / ou des nutriments supplémentaires peuvent être étudiés en détail. D'autres espèces, telles que B. subtilis (présenté ici), sont swarmers polyvalents, capables d'essaimage sur LB agar et granulé. Ces espèces pullulent facilement, nécessitant seulement ~ 10 h à développer un essaim plein. Ce taux essaimage rapide fait suite à la progression de l'essaim potentiellement difficile, mais notre protocole rend une telle suivi très faisable. La possibilité d'effectuer essaim imagerie time-lapse fournit un intérêt detiel facilité dans l'acquisition de données essaim, en particulier de ces swarmers avides.
Nous introduisons un solide, complet, le protocole à deux phases et des lignes directrices visant à améliorer l'exécution et la reproductibilité de la recherche de la motilité de surface bactérienne et avons surtout mis l'accent sur les aspects important d'examiner essaimage flagellaire médiation. Ce protocole d'essai essaim détails des aspects importants de la composition et la manipulation des plaques de la motilité de surface médias à fournir une plus grande cohérence et la reproductibilité à l'intérieur et entre les groupes de recherche. Cela permettra d'améliorer la base de la comparaison entre les différentes études de recherche. En outre, l'approche présentée et le protocole fournit les moyens de faire des recherches sur l'essaimage et la surface motilité moins sensibles aux variations de l'environnement en faisant chercheurs conscients que ces facteurs influent sur leur travail et fournir des solutions possibles (par exemple, comment de petits changements dans la gélose affectent essaimage 4,5 ). En outre, le protocole prévu pourquantifier aspects macroscopiques de l'essaimage, fournit l'occasion de mesurer de nombreux attributs de la croissance de la surface bactérienne qui étaient auparavant impossibles à quantifier.
Nous ne avons pas examiné toutes les bactéries mobiles de surface dans le développement de ce protocole. En tant que tel, il est prévu que les modifications du protocole seront requis pour les espèces ne sont pas présentés ici. L'efficacité de ce protocole est restreint par les limites inhérentes de l'équipement et des matériaux employés. Par exemple, des études sur les températures ne sont pas encore possible avec la station de formation d'image Bruker, étant donné que la régulation de température ne est pas une fonction de l'équipement. En outre, l'utilisation de colorants (comme le rouge Nil pour colorer rhamnolipides) peut avoir des limitations cinétiques et de concentration 8. Cette technique repose fortement sur le traitement et l'analyse d'images numériques; amélioration de l'automatisation de l'analyse des données (par exemple, en utilisant des macros supplémentaires de la fonction de script dans ImageJ) permettrait de réduire le temps nécessaire pour l'analyseet d'élargir l'utilité des données. Enfin, en raison de la robustesse du protocole d'imagerie, les applications futures devraient viser à développer cette technique pour examiner les surfaces de croissance moins uniformes qui sont plus pertinents pour les surfaces colonisées par des bactéries de l'environnement et pathogènes.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un soutien partiel pour ce travail a été fourni par l'Institut national de la santé (R01GM100470 et 1R01GM095959-01A1; à MA et JDS) et une subvention Core Facility de l'Institut des sciences clinique et translationnelle Indiana (financé en partie par le NIH subvention # TR000006 UL1; à JDS).
Materials
| Materials table | ||||
| Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
| Reagentsa: | ||||
| FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
| Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
| NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
| MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
| CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
| Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
| Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
| CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
| MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
| CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
| ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
| CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
| NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
| H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
| FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
| CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
| Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
| K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
| MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
| Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
| Additional Reagents: | ||||
| LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
| Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
| Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
| SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
| Relevant Materials and Equipment: | ||||
| Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
| Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
| Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
| In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
| Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
| ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. | ||||
References
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