Preparação, Imaging, e quantificação de Motilidade Ensaios superfície da bactéria
Summary
Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
Abstract
Motilidade superfície bacteriana, tal como enxame, é geralmente avaliada em laboratório usando ensaios em placa, que exigem a concentrações específicas de agar e, por vezes, a inclusão de nutrientes específicos no meio de crescimento. A preparação de tais meios explícitos e condições de crescimento superfície serve para fornecer as condições favoráveis que permitam não só o crescimento bacteriano mas motilidade coordenada de bactérias sobre estas superfícies dentro filmes líquidos finos. Reprodutibilidade da placa enxame e outros ensaios em placa de motilidade superfície pode ser um grande desafio. Especialmente para mais "Swarmers temperados" que exibem motilidade apenas dentro de intervalos de agar de 0,4% -0,8% (p / vol), pequenas alterações no ambiente de laboratório ou protocolo pode influenciar grandemente os resultados do ensaio do enxame. "Molhabilidade", ou do teor de água na interface líquido-sólido ao ar destes ensaios em placa, é muitas vezes uma variável chave para ser controlado. Um desafio adicional para a avaliação swarming é como quantificar observed diferenças entre duas (ou mais) experiências. Aqui nós detalhe um protocolo de duas fases versátil para preparar e ensaios imagem enxame. Nós incluem orientações para contornar os desafios comumente associados à preparação de meios ensaio enxame e quantificação de dados destes ensaios. Nós especificamente demonstrar o nosso método que utiliza bactérias que expressam repórteres genéticos fluorescentes ou bioluminescentes, como proteína fluorescente (GFP), luciferase (operon lux), verde ou manchas celulares para permitir imageamento óptico time-lapse. Demonstramos ainda mais a capacidade do nosso método para controlar as espécies que pululam competindo no mesmo experimento.
Introduction
Muitas bactérias movem em superfícies utilizando vários meios de auto-propulsão. Alguns fenótipos motilidade pode ser pesquisado em laboratório, utilizando ensaios de placas que são afetados pelo ambiente líquido associado à composição ensaio de placas semi-sólido. Um subconjunto de superfície útil ensaios em placa motilidade envolver ainda uma sala de ar gás fase normalmente. Assim, o resultado de qualquer ensaio de motilidade superfície particular, exige um cuidadoso controle da interface de três fases: a superfície sólida ambiental local, meio líquido, e propriedades do ambiente gás.
O modo de motilidade mais vulgarmente estudada em tal ensaio de três fases é conhecido como enxame. Enxameação é o movimento do grupo coordenado de células bacterianas que são movidos por seus flagelos através de filmes líquidos finos em superfícies 1. É tipicamente estudada em laboratórios usando ensaios em placa de semi-sólidos contendo 0,4% -0,8% (p / vol) de ágar 1. Uma matriz depatógenos humanos explorar esse comportamento motilidade para explorar e colonizar o hospedeiro humano. Por exemplo, Proteus mirabilis usa enxameação para subir na uretra, atingindo e colonizar a bexiga e os rins 2. Motilidade Enxameando é geralmente considerado um passo precursor para a formação de biofilme, a principal causa de patogénese em muitos patogénios humanos 3.
O fenótipo swarming é muito variada entre espécies bacterianas; sucesso experimental e reprodutibilidade dependem fortemente de factores como a composição de nutrientes, tipo agar e composição, protocolo de esterilização (por exemplo, autoclavagem), a cura meios semi-sólidos e umidade do ambiente (por exemplo, mudanças sazonais), entre outros 3-5. A variabilidade das respostas da motilidade superfície enfatiza os desafios encontrados nestes estudos e os meios de comunicação influência significativa e ambiente pode exercer. Para algumas espécies que pululam, tais como Pseudomonas, pululando motilid pode ocorrer em uma variedade de composições de meio, embora o fenótipo observado e que acompanha taxa de expansão enxame irá variar grandemente 3. Combinados, esses fatores podem fazer estudos de motilidade superfície extremamente desafiador. Variabilidade sazonal dentro de um laboratório pode influenciar estes ensaios trifásicos: ensaios podem funcionar melhor no-ar úmido do verão e pior no ar seco do inverno. Aqui apresentamos as diretrizes gerais para contornar alguns dos desafios mais notáveis quando se realiza estudo placa motilidade superfície.
Para alguns estudos da motilidade de superfície, o desenvolvimento de fenótipos específicos é de grande interesse. A maioria, mas não todos, os estudos, publicados examinar swarming de P. aeruginosa mostram a formação de rebentos ou fractais que irradiam a partir de um centro de inoculação 3-9. As diferenças entre P. estirpes aeruginosa têm sido documentados 5,8, mas em muito da presença ou ausência de gavinhas pode ser atribuído ao específic médio e protocolo utilizado para estes ensaios em placa de motilidade enxame. Aqui vamos incluir detalhes sobre como promover a formação de enxames tendril para P. aeruginosa. Porque P. aeruginosa é apenas uma das muitas bactérias que pululam, nós também incluem detalhes para o nosso método para examinar swarming de Bacillus subtilis e deslizamento de Myxococcus xanthus. Como P. aeruginosa, a pesquisa atual sobre B. subtilis e M. xanthus abrange uma variedade de tópicos como os pesquisadores estão trabalhando para discernir os aspectos da esporulação, motilidade, resposta ao estresse, e comportamento de transição de 1,10. Existe uma necessidade de quantificar e os padrões de comportamento dinâmica do (s) específico para estas células em grupos que infestam.
Aquisição de dados motilidade Surface, análise e interpretação pode ser complicado e qualitativa. Nós desenvolvemos um protocolo para a análise macroscópica detalhada dos enxames bacterianas que fornece, além de enxame morfologia zona e sIze (por exemplo, de diâmetro), a informação dinâmica quantitativa em relação à taxa de expansão enxame e bacteriana ou densidade bioprodutos distribuição 7. Além disso, este método pode tirar vantagem das proteínas fluorescentes disponíveis, luminescência, e corantes para obter uma visão global de interacções bacterianas 8, bem como para controlar a síntese de bioprodutos (por exemplo, P. aeruginosa ramnolipido 7,8) dentro de um enxame.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alcançar swarming reproduzível em laboratório pode ser um desafio, como ensaios enxame são altamente sensíveis a fatores ambientais, tais como umidade e nutrientes disponíveis. O aspecto mais crítico de um ensaio de placa de motilidade superfície humidade na superfície do agar. Antes da inoculação, media enxame deve estar seco o suficiente para evitar que as células bacterianas de nadar em todo o líquido da superfície, mas não tão seco como para inibir a enxameação 5. A incubação deve ocorrer em um ambiente suficientemente úmido: muito pouca umidade pode resultar no ensaio de secagem durante a incubação, enquanto muita umidade pode levar a superfície artificial ou artifactual espalhando. A menos que uma incubadora de umidade controladas está à mão, incubadora e laboratórios umidade pode variar drasticamente. Por conseguinte, um reservatório de água adicional, um humidificador ou um desumidificador dentro da incubadora pode ser necessário para evitar o excesso de secagem ou a acumulação de excesso de humidade, mantendo o Relative umidade perto de 80%. A manutenção dessa umidade ideal pode ser um desafio, se mudanças de umidade sazonais são significativas. Se este for o caso, o protocolo de ensaio enxame vai exigir alguns ajustes para explicar as mudanças sazonais na umidade. Descobrimos que modificar o tempo de secagem da mídia enxame é a maneira mais simples para ajustar para mudanças de umidade sazonais. Monitoramento de umidade constante, tanto dentro como fora da incubadora, é recomendado. Além disso, recomenda-se que os pesquisadores calibrar e validar os seus instrumentos, incubadoras, balanças, etc. erros como menores na temperatura, volume ou quantidade de componentes de mídia pode afetar a reprodutibilidade destes ensaios.
Deve também ser notado que o tipo e tamanho da placa utilizada no ensaio pode afectar a placa de humidade, e, assim, enxame. Placas hermeticamente fechados não desabafar o excesso de umidade, assim motilidade natação encorajador. Em contraste, as placas de face aberta permitem muita umidade para escapar. Uma placa de Petrifornece um ambiente ideal porque desabafa off suficiente excesso de umidade para evitar que o líquido se acumulam, mas retém a umidade suficiente para impedir a mídia de secar. Este método detalha um protocolo de ensaio de motilidade superfície que permite a imagem de alta qualidade. Para manter o agar clara para pratos de imagem 60 milímetros de diâmetro são preenchidos com 7,5 ml de ágar. Se imagiologia detalhada não é necessária, os volumes de até 20 ml, também pode proporcionar resultados reprodutíveis.
Enquanto motilidade enxame pode ser conseguida através de uma ampla gama de concentrações de ágar, a gama óptima de ágar necessária para enxame depende das espécies. No geral, mais elevadas concentrações de ágar inibem enxameação e, conseqüentemente, o tempo necessário para produzir uma imagem pronta enxame aumenta. P. aeruginosa geralmente pulula sobre as concentrações de ágar entre 0,4-0,7% 1, no entanto, descobrimos que swarming ideal ocorre em uma faixa muito estreita (0,4-0,5%). Outros, como B. subtilis e S. entéricoum enxame de 0,6% de ágar e Vibrio parahaemolyticus em 1,5% agar 10. A concentração necessária de ágar também é determinada pelo tipo e marca de ágar. Maiores agares de pureza, como agar Noble, fortemente aprimorar pululando em P. aeruginosa e são preferidos em relação granulado ágar 13,14. No entanto, estas versões purificadas de ágar são também mais propensas a caramelização durante o ciclo de esterilização em autoclave; dependendo do instrumento, um encurtado / sequência de esterilização modificado (para possivelmente alterar o ciclo de escape para evitar a exposição prolongada do calor) pode ser necessária para preparar a mídia enxame utilizando ágar Noble.
Composição de mídia também desempenha um papel no fenótipo enxame observado 3. P. aeruginosa estudos da motilidade swarming geralmente são realizadas por meio de nutrientes mínimos. Nós preferimos FAB médio de 4,8 (Tabela de Materiais), mas outros meios de comunicação, tais como M9, LB, ou pequenas variações para essas mídias comuns,têm sido utilizados com sucesso 9,15,16. Formação Rebento é melhor conseguida em FAB meio mínimo suplementado com glucose como fonte de carbono e de casaminoácidos (CAA), mas sem uma fonte de azoto adicional (ou seja, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. Se a formação do cacho ou morfologia não é o foco principal do estudo, então FAB meio mínimo (Tabela de Materiais; Tabela 1) desprovida de CAA é recomendado para que os efeitos das fontes de carbono específicos e / ou nutrientes adicionais podem ser estudados em detalhe. Outras espécies, tais como B. subtilis (apresentado aqui), são swarmers versáteis, capazes de pululando em LB e agar granulado. Estas espécies enxame facilmente, necessitando apenas de ~ 10 horas para desenvolver um enxame inteiro. Esta taxa rápido swarming faz seguindo a progressão do enxame potencialmente difícil, mas nosso protocolo faz tal rastreamento muito viável. A capacidade de realizar enxame de lapso de tempo de imagem fornece uma substancial facilidade na aquisição de dados enxame, particularmente a partir de tais swarmers ávidos.
Nós introduzimos um, abrangente protocolo de duas fases robusto e orientações destinadas a melhorar a execução e reprodutibilidade da pesquisa motilidade superfície bacteriana e têm enfatizado principalmente aspectos importante examinar swarming mediada por flagelar. Este protocolo de ensaio enxame detalhes importantes aspectos da composição do meio e manuseio de placas de motilidade superfície para dar uma maior consistência e reprodutibilidade dentro e entre os grupos de pesquisa. Isto irá melhorar a base de comparação entre os diferentes estudos de investigação. Além disso, a abordagem apresentada e protocolo fornece meios para fazer pesquisa sobre swarming e superfície motilidade menos suscetíveis a variações ambientais, fazendo pesquisadores cientes de que tais fatores afetam o seu trabalho e fornecimento de soluções possíveis (por exemplo, como pequenas mudanças na agar afetar swarming 4,5 ). Além disso, o protocolo fornecido paraquantificar aspectos macroscópicos da swarming, oferece uma oportunidade para medir muitos atributos de crescimento da superfície bacteriana que antes eram inquantificável.
Nós não examinaram todas as bactérias de superfície motilidade no desenvolvimento deste protocolo. Como tal, espera-se que as modificações do protocolo irá ser necessária para espécies não apresentados aqui. A eficiência deste protocolo será restringido pelos limites inerentes ao equipamento e os materiais utilizados. Por exemplo, estudos de temperatura relacionado não são possíveis ainda com a estação de imagens Bruker, uma vez que o controlo de temperatura não é uma característica do equipamento. Além disso, a utilização de corantes (tal como Vermelho do Nilo para corar rhamnolipídeos) pode ter limitações cinéticas e de concentração 8. Esta técnica baseia-se fortemente sobre o processamento e análise de imagens digitais; melhor automação de análise de dados (por exemplo, usando Macros adicionais de função script no ImageJ) reduziria o tempo necessário para análisee expandir a utilidade dos dados. Finalmente, devido à robustez do protocolo de imagem, aplicações futuras devem visar a expansão dessa técnica para examinar as superfícies de crescimento menos uniformes que são mais relevantes para superfícies colonizados por bactérias ambientais e patogênicos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Suporte parcial para este trabalho foi fornecida pelo Instituto Nacional de Saúde (R01GM100470 e 1R01GM095959-01A1; a MA e JDS) e uma subvenção Núcleo Facility do Instituto de Ciências clínica e translacional Indiana (financiado em parte pelo NIH conceder # UL1 TR000006; a JDS).
Materials
| Materials table | ||||
| Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
| Reagentsa: | ||||
| FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
| Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
| NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
| MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
| CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
| Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
| Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
| CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
| MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
| CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
| ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
| CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
| NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
| H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
| FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
| CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
| Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
| K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
| MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
| Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
| Additional Reagents: | ||||
| LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
| Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
| Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
| SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
| Relevant Materials and Equipment: | ||||
| Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
| Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
| Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
| In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
| Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
| ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. | ||||
References
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews: Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Burall, L. S., et al. et al.Proteus mirabilis. genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: Identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infection and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa. biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PLoS One. 6 (6), e20888 (2011).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa. swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M., O’Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Du, H., et al. High density waves of the bacterium Pseudomonas aeruginosa. in propagating swarms result in efficient colonization of surfaces. Biophysical Journal. 103 (3), 601-609 (2012).
- Morris, J. D., et al. Imaging and analysis of Pseudomonas aeruginosa. swarming and rhamnolipid production. Appl Environ Microbiol. 77 (23), 8310-8317 (2011).
- Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa. swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. J Bacteriol. 195 (5), 909-918 (2013).
- Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis .do not exhibit swarming motility. Journal of Bacteriology. 191 (22), 7129-7133 (2009).
- . . Molecular Imaging. , (2014).
- Harshey, R. M., Matsuyama, T. Dimorphic transition in Escherichia coli. and Salmonella typhimurium.: surface-induced differentiation into hyperflagellate swarmer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 91 (18), 8631-8635 (1994).
- Rashid, M. H., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa. Proc Nat Acad Sci U.S.A.. 97 (9), 4885-4890 (2000).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O’Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa. PA14. Journal of Bacteriology. 189 (9), 3603-3612 (2007).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic-di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa.: the pilY1. gene and its impact on surface-associated behaviors. J Bacteriol. 192 (12), 2950-2964 (2010).
