Живая съемка врожденной иммунной и предраковых межклеточного взаимодействия, используя / UAS Expression System Индуцибельная Gal4 на личиночной данио рерио кожи

В процессе эмбриогенеза и развитие личинок, эмбриональная данио кожи состоит из двух эпителиальных слоев, поверхностный слой называют перидермы и слой базальных кератиноцитов, которые прикреплены к основной базальной мембраны ¹⁹ (фиг 1С,). Протокол, представленные здесь описывает простой метод условно индуцировать трансформацию предраковый-клеток в поверхностном слое кожи данио личинок, и позволяет для последующего анализа взаимодействия с врожденных иммунных клеток живой визуализации. Основные методики в нашем протоколе следовать хорошо апробированных методов рыбок данио ^{9 – 13,} и наш протокол может быть легко адаптирован и изменен.

Krt4 промоутер ⁵ используется здесь запускает экспрессию ^T2 KalTA4-ER частности, в наружном слое кожи (рис 1С, б). Тем не менее, модульная MultiSite шлюзклонирования стратегию, используемую для генерации krt4: KalTA4-ER ^T2 конструкцию (рис 1D,), обеспечивает возможность клонирования любой промотор интереса перед KalTA4-ER ^T2 в одном шаге клонирования. Адаптация метода, изложенного в настоящем документе, поэтому возможно для большинства тканей во время эмбриогенеза и в личиночной стадии. Наличие промоторных последовательностей является самым ограничивающим фактором. Кроме того, почти любой ген интерес клонированный за UAS можно условно избыточно экспрессируется на разных стадиях развития с использованием выражения пространственной и временной контролируемой KalTA4-ER ^T2. Таким образом, наш протокол может быть выполнен с возможностью осуществления экспрессии гена в условной любой интересующей ткани в данио личинок, в мозаичном порядке. Можно также оптимизировать микроскоп настройки для того, чтобы жить изображения глубокие ткани, такие как печень или поджелудочная железа.

Мы описали одну заявку, используя протокол онРе, аналогично, можно сверхэкспрессировать другие воспалительные модуляторы, используя этот протокол для изучения регуляции воспалительных реакций, как легко жить нейтрофилов изображения и макрофагов изменения в поведении следующие индукции и ареста в экспрессии кандидата воспалительного модулятора. Кроме того, адаптирован протокол также будет полезным для тех, кто хочет проследить движение клеток и изменение поведения на различных этапах ткани морфогенеза и формирования органов и, наконец, живое изображение взаимодействия врожденных межклеточных взаимодействий иммунных с другими специфическими клеточными линий, которые могут быть направлены индуцируемой KalTA4-ER системы экспрессии ^T2 / UAS.

Мы использовали вектор pDestTol2CG от рыбок данио Tol2kit ^{20 – 23,} который содержит cmlc2: EGFP-PA кассеты (рис 1D,), которая позволяет последующим отбором эмбрионов зелеными флуоресцентными положительных сердцах как таковойЛекция Маркер ^20, что упрощает процесс отбора F0. Стабильная вставка транспозона бокам интересующего гена в геном облегчается при совместной инъекции плазмидной ДНК вместе с транспозазы мРНК. Получение плазмидной ДНК и транспозаза мРНК микроинъекции следующим стандартных протоколов. Тем не менее, успешной интеграции конструкции в геном зависит от Tol2 основе транспозиции ^14. Это подчеркивает особое внимание будет уделено работе на льду в стерильных условиях, чтобы избежать загрязнения и ухудшения по РНКаз и ДНКаз. Микроинъекции в эмбрионы одноклеточных этапе является надежным и хорошо разработанный метод усиления и потери функциональных исследований в данио ^9,10. Хотя хорошо обученный человек может легко вводить в желток более 1000 эмбрионов в 1 час, введение в бластодиска (рис 1а, звездочка) требует больше опыта и подготовки. Критический во время этой процедуры ях годов обработки иглы. Иглы должен быть очень тонким, чтобы проникнуть в клетку без повреждений и, следовательно, должен быть разбит только на самом ее конце. Важно, чтобы регулярно контролировать и измерять размер капли во время инъекции, чтобы гарантировать равномерное инъекции в каждого эмбриона. Тщательно обработаны, игла может быть использована, чтобы повернуть эмбриона. Это часто необходимо найти бластодиск и оптимальный угол проникновения.

Концентрация ДНК и транспозаза мРНК использовали для инъекций наверняка влияет на эффективность экспрессии. Более высокие дозы могут привести к увеличению доли клеток, экспрессирующих трансген, но с более высокими концентрациями ДНК (> 50 нг / мкл) и транспозаза мРНК (> 100 нг / мкл) также не возникнет потенциал для токсических эффектов среди вводимых эмбрионов. Мы за использование 10 нг / мкл ДНК и 20 нг / мкл мРНК транспозаза для инъекции, что соответствует 50 мкг плазмидной ДНК и 100 мкг РНК на впрыскиваемого набРио. 100% эмбрионов, инъецированных этих концентраций у нормально развиваться, а также между 40-70% показать EGFP-HRAS выражение ^G12V, после индукции 4-OHT, в зависимости от эффективности инъекции в одной ячейке. Среди положительных эмбрионов мы обычно находим приблизительно 30%, которые имеют 1-10 клонов, 40%, которые имеют 10-50 клонов и 30% Имея более чем 50 клонов. Благодаря нашим научно-исследовательских целей, мы выступаем за использование эмбрионов с меньшим количеством клонов, выражающих EGFP-HRAS ^G12V. Мы выбираем эмбрионов 10-50 клонов для наших переходных экспериментов. Для получения трансгенных основателя рыбы, мы рекомендуем выбрать только эмбрионов как с EGFP положительной сердечной маркера и большого количества EGFP-HRAS ^G12V положительных клонов в своих эпидермиса.

(Z) -4-гидрокситамоксифен претерпевает цис-транс (EZ) взаимопревращение при воздействии света ^24. Было обнаружено, что цис-изомер (Е) 100x менее анти-эстрогенным, чем его аналог транс ^25,26. Exposurе света, поэтому следует избегать. Исходный раствор 4-ОНТ растворяют в этаноле можно хранить при -20 ° С в темноте в течение длительного периода времени. Мы рекомендуем использовать коробку для защиты чашки Петри от света гена-мишени индукции внутри инкубатора и транспорта. Хотя область визуализации очень мал и воздействие 4-ОНТ в УФ-свете сводится к минимуму, постоянного обмена индукции раствора каждые 2 часа, пока изображения в течение длительного периода времени, рекомендуется, чтобы поддерживать максимальные уровни экспрессии. 4-ОНТ эффективно permeabilizes через хориона и наружных слоев кожи во время данио эмбриогенеза, поэтому он может индуцировать экспрессию гена очень быстро. Мы можем легко наблюдать излучение EGFP после 2 часов индукции и сообщалось, что первые признаки экспрессии гена-мишени можно наблюдать через 1 час и плато, после 3 часов лечения ^8. Различия могут быть из-за различных промотора, используемого в нашем исследовании. Как уже прeviously сообщил, что 4-OHT лечение зависит от дозы ^8,27, мы решили использовать Максимальные концентрации 5 мкМ для достижения надежных и воспроизводимых уровни экспрессии в нашем переходном подхода. Это должно гарантировать, что все клетки, несущие трансген будет индуцировать экспрессию гена-мишени.

Это должно быть принято во внимание, что переходный подход, представленный здесь, может привести к разным уровнем экспрессии в связи с возможностью нескольких случайных событий и вставки генома. Кроме того, использование транспозазы мРНК в Tol2 трансгенных фоне ТГ (БАС: EGFP-HRAS ^G12V) io006 может привести к потенциальным перестановок трансгена UAS, что может привести к сайленсинга или нарушения. Однако, как метод, представленный здесь, представляет собой переходный подход, предварительный отбор эмбрионов последующих до инъекции является обязательным. Многие лаборатории было обнаружено, что последовательности UAS, как правило, быть подавлен в трансгенных потомков, следовательно, вjecting в pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: EGFP построить в TG (UAS: EGFP-HRAS ^G12V) io006 эмбрионов может быть не так эффективно, как потребители инъекционных UAS конструкции в TG (krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: GFP ) эмбрионов. Использование стабильной трансгенной линии Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2) пересекается с Tg (UAS: EGFP-HRAS ^G12V) io006 позволит точно контролировать ON / OFF кинетики времени дозировки зависит активации гена 4-OHT ,

Важным шагом при монтаже личинок перевод на агарозы LMP и на покровного стекла (рис 1б). Существует только короткие сроки, для жидкого LMP агарозном температуры, которая позволяет безопасную передачу и ориентацию на предварительно выбранный личинок без ущерба для рыбы, либо теплового шока или затвердевания геля. Личинки должны быть ориентированы непосредственно на покровное стекло, чтобы уменьшить рабочее расстояние для последующего микроскопического анаSiS. Как это может быть ограничивающим фактором при микроскопии выбор соответствующих целей является обязательным. После подключения личинка может поддерживаться от нескольких часов до нескольких дней.

Обусловленность модельной системе, представленной в настоящем документе даёт для повторяющихся преобразований по 4-OHT активации трансгена. Система экспрессии зависит от наличия 4-ОНТ и, следовательно, KalTA4 контролируемой экспрессии интересующего гена обратимо (рис 1D, б). В отличие от Cre-ER ^T2 / LOX системы, что облегчает необратимый геномной событие рекомбинации ^28, KalTA4-ER ^Т2 / UAS может быть включается и выключается при добавлении или удалении 4-ОНТ и этот потенциал для повторного индукции является преимуществом Техника по Cre-ER ^T2 системы / LOX. Тем не менее, потребность в постоянном уровне 4-ОНТ является ограничением, если эксперимент должен быть продлен от нескольких дней до недель.