Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Durante l'embriogenesi e sviluppo larvale, la pelle zebrafish embrione è composto da due strati epiteliali, lo strato superficiale chiamato periderm e uno strato di cheratinociti basali che sono attaccati alla membrana basale sottostante ¹⁹ (Figura 1C, a). Il protocollo presentato qui descrive un metodo semplice per indurre condizionale trasformazione preneoplastiche cellule nello strato superficiale della pelle di larve di zebrafish, e permette per la successiva analisi interazione con le cellule immunitarie innate di immagini dal vivo. Le metodologie di base nel nostro protocollo seguono tecniche di zebrafish consolidate ^9-13, e il nostro protocollo possono essere facilmente adattati e modificati.

Il promotore krt4 ⁵ qui utilizzato spinge espressione ^T2 KalTA4-ER specificamente nello strato più esterno della pelle (Figura 1C, b). Tuttavia, l'modulare MultiSite Gatewayclonazione strategia utilizzata per generare la krt4: KalTA4-ER ^T2 costrutto (Figura 1D, a), prevede la possibilità di clonare qualsiasi promotore di interesse davanti KalTA4-ER ^T2 in un unico passaggio clonazione. Un adattamento del metodo presentato qui è quindi possibile per la maggior parte dei tessuti durante l'embriogenesi e stadi larvali. La disponibilità di sequenze promotore è presente il fattore limitante. Inoltre, quasi ogni gene di interesse clonato dietro un UAS può essere condizionale sovraespresso a diversi stadi di sviluppo mediante la espressione KalTA4-ER ^T2 spaziale e controllata temporalmente. Pertanto, il nostro protocollo può essere adattato per eseguire l'espressione genica condizionale in qualsiasi tessuto di interesse nelle larve zebrafish, in maniera mosaico. Si può anche ottimizzare l'impostazione per vivere immagine tessuti più profondi, come il fegato o del pancreas microscopio.

Abbiamo descritto una sola applicazione che utilizza il protocollo cheRé, allo stesso modo, si può iperespressione altri modulatori infiammazione utilizzare questo protocollo per studiare la regolazione delle risposte infiammatorie, come si può facilmente neutrofili immagine dal vivo e cambiamenti comportamentali macrofagi seguenti l'induzione e l'arresto nella espressione di un modulatore infiammatorio candidato. Inoltre, il protocollo adatto sarebbe anche utile per coloro che vogliono seguire il movimento delle cellule e il cambiamento del comportamento durante le diverse fasi della morfogenesi dei tessuti e la formazione di organi e, infine, l'immagine dal vivo l'interazione delle interazioni cellule immunitarie innate con altre linee cellulari specifici che può essere mirata dal sistema di espressione ^T2 / UAS KalTA4-ER inducibile.

Abbiamo usato il vettore pDestTol2CG dal Tol2kit zebrafish ^{20 – 23} che contiene un cmlc2: eGFP-pA cassetta (figura 1D, a) che consente la successiva selezione degli embrioni da verdi fluorescenti cuori positivi come selection marcatore ²⁰ che semplifica il processo di screening F0. Un inserimento stabile del trasposone affiancato gene di interesse nel genoma è facilitato dalla co-iniezione del DNA plasmidico insieme trasposasi mRNA. La preparazione di DNA plasmidico e l'mRNA trasposasi per microiniezione segue protocolli standard. Tuttavia, una riuscita integrazione del costrutto nel genoma dipende dalla trasposizione-based Tol2 ^14. Ciò evidenzia la particolare attenzione da pagare per lavorare sul ghiaccio in condizioni sterili per evitare contaminazioni e degradazioni da RNasi e DNasi. Microiniezione in una delle cellule di embrioni stadio è una tecnica robusta e consolidata per il guadagno e la perdita di studi di funzionalità in ^9,10 zebrafish. Anche se una persona ben addestrato può facilmente iniettare nel tuorlo di oltre 1.000 embrioni in 1 ora, l'iniezione nel blastodisco (Figura 1A, asterisco) richiede più esperienza e formazione. Critical durante questa procedura is la manipolazione dell'ago. L'ago deve essere molto sottile per penetrare la cella senza danni e deve pertanto essere rotto solo sulla sua punta estrema. È importante controllare periodicamente e misurare la dimensione della goccia durante l'iniezione di garantire un'iniezione uniforme in ogni embrione. Ben curate, l'ago può essere usato per ruotare l'embrione. Questo è spesso necessario per trovare il blastodisco e l'angolo di penetrazione ottimale.

La concentrazione di DNA e mRNA trasposasi utilizzato per l'iniezione quasi certamente influenza l'efficienza di espressione. Dosi più elevate possono portare ad un aumento della percentuale di cellule che esprimono il transgene ma con maggiori concentrazioni di DNA (> 50 ng / ml) e trasposasi mRNA (> 100 ng / ml), anche la possibilità di effetti tossici tra embrioni iniettati si pone. Noi preferiamo l'uso di 10 ng / ml DNA e 20 ng / ml trasposasi mRNA iniettabile, che corrisponde a 50 pg di DNA plasmidico e 100 pg di RNA per emb iniettatoryo. 100% degli embrioni iniettati con queste concentrazioni si sviluppano normalmente, e tra il 40-70% mostra eGFP-HRAS espressione ^G12V, dopo induzione 4-OHT, a seconda dell'efficienza iniezione nella singola cella. Tra embrioni positivi vengono normalmente troviamo circa il 30% che ha 1-10 cloni, 40% che ha 10-50 cloni e 30% con più di 50 cloni. Grazie ai nostri obiettivi di ricerca, privilegiamo l'uso di embrioni con un minor numero di cloni che esprimono eGFP-HRAS ^G12V. Selezioniamo embrioni con 10-50 cloni per i nostri esperimenti transitori. Per la generazione di pesci transgenici fondatore, si consiglia di selezionare solo gli embrioni sia con il marcatore cardiaco positivo eGFP e un gran numero di eGFP-HRAS ^G12V cloni positivi nelle loro epidermide.

(Z) -4-Hydroxytamoxifen subisce un cis-trans (EZ) interconversione quando esposto alla luce ^24. Si è constatato che l'isomero cis (E) è 100x meno anti-estrogenica rispetto al suo omologo trans ^25,26. Exposure alla luce deve quindi essere evitato. La soluzione madre 4-OHT disciolto in etanolo può essere conservato a -20 ° C al buio per un periodo di tempo lungo. Si consiglia l'uso di una scatola per proteggere le capsule di Petri dalla luce durante l'induzione del gene bersaglio all'interno dell'incubatrice e trasporti. Anche se l'area di imaging è molto piccolo e l'esposizione di 4-OHT alla luce UV è ridotta al minimo, un continuo scambio di soluzione induzione ogni 2 ore, mentre l'imaging in periodi di tempo più lunghi si raccomanda di mantenere i livelli massimi di espressione. 4-OHT permeabilizes efficace attraverso il corion e gli strati più esterni della pelle durante l'embriogenesi zebrafish, quindi può indurre l'espressione genica molto rapidamente. Possiamo facilmente osservare emissione eGFP dopo 2 ore di induzione ed è stato riferito che i primi segni di espressione target-gene possono essere osservati dopo 1 ora e plateau dopo 3 ore di trattamento ^8. Le differenze possono essere dovute al diverso promotore utilizzato nel nostro studio. Come è stato previously ha riferito che il 4-OHT trattamento dipende dalla dose ^8,27, abbiamo scelto di utilizzare la più alta concentrazione segnalato 5 micron di raggiungere livelli di espressione robusti e riproducibili nel nostro approccio transitoria. Questo dovrebbe garantire che tutte le cellule che trasportano il transgene saranno indurre l'espressione del gene bersaglio.

Si deve tenere conto che l'approccio transitorio qui presentato potrebbe portare a diversi livelli di espressione per la possibilità di eventi multipli e casuali inserimento genoma. Inoltre, l'uso del mRNA trasposasi in background transgenico Tol2 di Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 può portare a possibili trasposizioni del transgene UAS che potrebbe provocare silenziamento genico o interruzione. Tuttavia, poiché il metodo qui presentato rappresenta un approccio transitorio, la pre-selezione di embrioni successive a iniezione è obbligatoria. Molti laboratori hanno scoperto che le sequenze SUP tendono ad essere messa a tacere nella prole transgenica, quindi inproietta il pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP costruire in Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 embrioni potrebbe non essere efficiente come l'iniezione di un UAS costrutto in Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: GFP ) embrioni. L'uso della scuderia linea transgenica Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2) attraversato con Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 consentirà un monitoraggio preciso dei / off sulla cinetica del tempo-dose dipendente l'attivazione del gene 4-OHT .

Un punto critico durante il montaggio delle larve è il trasferimento nella agarosio LMP e sul vetro di copertura (Figura 1B). C'è solo un breve lasso di tempo per il liquido temperatura agarosio LMP che consente un trasferimento sicuro e l'orientamento delle larve preselezionato senza danneggiare il pesce da uno shock termico o indurimento del gel. Le larve deve essere orientato direttamente sul vetro di copertura per ridurre la distanza di lavoro per la successiva analy microscopicasis. Poiché questo può essere un fattore limitante durante microscopia scelta degli obiettivi appropriati è obbligatoria. Una volta montato, la larva può essere mantenuta da ore a giorni.

La condizionalità del sistema modello presentato qui permette per la trasformazione ripetuto da 4-OHT attivazione del transgene. Il sistema di espressione dipende dalla presenza di 4-OHT e quindi espressione KalTA4 controllata di un gene di interesse è reversibile (Figura 1D, b). In contrasto con il sistema Cre-ER ^T2 / Lox, che facilita un evento irreversibile ricombinazione genomica ^28, KalTA4-ER ^T2 / UAS può essere attivato e disattivato dopo l'aggiunta o la rimozione di 4-OHT e questo potenziale di induzione ripetuta è un vantaggio la tecnica sul sistema ^T2 / Lox Cre-ER. Tuttavia, la necessità di livelli costanti di 4-OHT è una limitazione se l'esperimento deve essere prolungata da giorni a settimane.