El estudio de los primeros eventos de la progresión de células preneoplásicas y la interacción célula inmune innata es fundamental para entender y tratar el cáncer. Aquí se describe un método para inducir condicionalmente transformaciones de células epiteliales y la formación de imágenes en directo posterior de la interacción de células inmune innato con HRAS G12V expresando células de la piel en las larvas de pez cebra.
Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.
El crecimiento excesivo de una progenie de células preneoplásicas dentro de una hoja epitelial de otro modo normal depende en gran medida de una interacción con su microambiente. La interacción con su tejido del huésped es probable que sea el principal determinante de si una célula preneoplásicas es capaz de establecer un nicho clonal para seguir desarrollando en un cáncer completo soplado. A pesar de su importancia en el desarrollo, esta fase inicial de la progresión del cáncer es inaccesible en sistemas modelo más comúnmente utilizados, in vivo.
El pez cebra, Danio rerio, es un organismo modelo bien establecido para los estudios de imagen en vivo debido a su transparencia durante todo el desarrollo, la posibilidad de que la manipulación genética y la accesibilidad de los medicamentos solubles en agua. Estudios recientes utilizando un modelo de larvas de pez cebra, que sobreexpresan el oncogén humano HRAS G12V para transformar las células epiteliales, mostraron que la célula huésped señales de deriva, en particular, H 2 O 2 originanel reclutamiento de células inmunes innatas. Curiosamente, los reclutados células inmunes, neutrófilos y macrófagos, se demostrado tener un papel trófico en el apoyo a la proliferación de células preneoplásicas 2,3.
Con el fin de entender los eventos tempranos de la iniciación y progresión del tumor, así como la contribución de una respuesta inflamatoria, uno tiene que ser capaz de imagen estos eventos desde el punto de tiempo más temprano en adelante. Por lo tanto, es necesario controlar las transformaciones de células de una manera específica temporal y de tejido. Utilizamos el sistema / UAS Gal4 que ha sido adaptado con éxito a partir de Drosophila 4 para expresar condicionalmente el oncogén humano HRAS G12V bajo el control del promotor específico de la piel queratina 4 (krt4) 5. La versión modificada del activador transcripcional Gal4, a saber KalTA4 6, permite la expresión de HRAS G12V bajo el control de la secuencia de activación aguas arriba (UAS). Para inducir la expresión condicional activador transcripcional, KalTA4 se ha fusionado con el dominio de unión a ligando mutante de los α del receptor de estrógenos humanos (ER T2) 7 que se une específicamente 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) 1. A falta de 4-OHT la ER T2 está ligada en el citoplasma de las proteínas de choque térmico. Tras 4-OHT la unión del choque térmico se disocian proteínas, lo que permite una translocación nuclear de KalTA4-ER T2 y la activación subsiguiente de los UAS gen de interés controladas 8 (Figura 1C, b). Como este sistema de expresión depende de la presencia de 4-OHT, la expresión KalTA4 controlada de un gen de interés es reversible. En contraste con el / Lox sistema Cre-ER T2, lo que conduce a un evento de recombinación irreversible, la inducción de la activación transcripcional por KalTA4-ER T2 es reversible mediante la adición o eliminación de 4-OHT.
El siguiente protocolo allo ws una transformación condicional de células de la piel en las larvas de pez cebra y un posterior seguimiento de la interacción con las células inmunes innatas de expresión de la proteína fluorescente. Las metodologías básicas empleadas en este protocolo son similares a algunas de las técnicas de uso común dentro de la comunidad de pez cebra 9-13.
La generación y el uso combinatoria de líneas transgénicas junto con la microinyección de construcciones transgénicas permite un enfoque transitoria sólo para transformar células individuales en forma de mosaico. La permeabilidad al oxígeno de la piel del pez cebra embrionario y larval plantea la posibilidad de time-lapse estudios de imagen en vivo de alta resolución de la microscopía de horas a días. Por otra parte, su accesibilidad a las drogas solubles en agua permitirá que los futuros estudios mecanicistas y el seguimiento de los eventos biológicos de células in vivo que podrían conducir a una mejor comprensión de las etapas más tempranas del desarrollo del cáncer.
_content "> Este protocolo puede ser adaptado para realizar la expresión génica condicional en cualquier tejido de interés en larvas de pez cebra, en una forma de mosaico. También se puede optimizar la configuración para vivir imagen tejidos más profundos distintos de piel microscopio.Durante la embriogénesis y el desarrollo de las larvas, la piel embriones de pez cebra se compone de dos capas epiteliales, la capa superficial llamada peridermis y una capa de queratinocitos basales que están unidos a la membrana basal subyacente 19 (Figura 1C, a). El protocolo que se presenta aquí describe un método directo para inducir condicionalmente transformación de células preneoplásicas en la capa superficial de la piel de las larvas de pez cebra, y permite el análisis de la interacción posterior con células inmunes innatas por imágenes en vivo. Las metodologías básicas en nuestro protocolo siguen las técnicas de pez cebra bien establecidos 9-13, y el protocolo se pueden adaptar y modificar fácilmente.
El promotor krt4 5 utilizado aquí impulsa KalTA4-ER expresión T2 específicamente en la capa más externa de la piel (Figura 1C, b). Sin embargo, el modular MultiSite pasarelaestrategia de clonación, utilizado para generar la krt4: KalTA4-ER T2 constructo (Figura 1D, a), ofrece la posibilidad de clonar cualquier promotor de interés en frente de KalTA4-ER T2 en una sola etapa de clonación. Una adaptación del método presentado en el presente documento tanto, es posible para la mayoría de los tejidos durante la embriogénesis y estadios larvarios. La disponibilidad de secuencias de promotor es por la presente el factor limitante. Además, casi cualquier gen de interés clonado detrás de una UAS puede ser sobreexpresada condicionalmente en diferentes etapas de desarrollo mediante el uso de la expresión KalTA4-ER T2 espacial y temporalmente controlada. Por lo tanto, nuestro protocolo se puede adaptar para llevar a cabo la expresión génica condicional en cualquier tejido de interés en larvas de pez cebra, en una forma de mosaico. También se puede optimizar la configuración para vivir imagen tejidos más profundos tales como el hígado o el páncreas microscopio.
Hemos descrito una aplicación que utiliza el protocolo de élRe, de manera similar, se puede sobreexpresan otros moduladores de la inflamación usando este protocolo para el estudio de la regulación de las respuestas inflamatorias, como se puede neutrófilos imagen fácilmente en directo y los cambios de comportamiento de los macrófagos después de la inducción y la detención en la expresión de un modulador inflamatoria candidato. Además, el protocolo adaptado también sería beneficioso para aquellos que quieren rastrear el movimiento celular y el cambio de comportamiento durante las diferentes etapas de la morfogénesis de tejidos y la formación de órganos y, finalmente, la imagen en vivo de la interacción de células inmunes innatas interacciones con otros linajes celulares específicos que se pueden orientar por el sistema de expresión T2 / UAS KalTA4-ER inducible.
Se utilizó el vector pDestTol2CG del Tol2kit pez cebra 20-23 que contiene una cmlc2: eGFP-pA casete (Figura 1D, a) que permite la posterior selección de embriones por verdes fluorescentes corazones positivos como semarcador lección 20 que simplifica el proceso de selección F0. Una inserción estable del gen de transposón flanqueado de interés en el genoma se ve facilitada por co-inyección del ADN plásmido junto con ARNm transposasa. La preparación de plásmido de ADN y el ARNm transposasa para la microinyección sigue protocolos estándar. Sin embargo, una integración exitosa de la construcción en el genoma depende de la transposición a base de Tol2 14. Esto pone de relieve la especial atención que se pagará a trabajar en el hielo en condiciones estériles para evitar contaminaciones y degradaciones por RNasas y DNasas. La microinyección en embriones de fase de una célula es una técnica sólida y bien establecida para la ganancia y la pérdida de los estudios de función en 9,10 pez cebra. Aunque una persona bien entrenada puede inyectar fácilmente en la yema de más de 1.000 embriones en 1 h, la inyección en el blastodisco (Figura 1A, asterisco) requiere más experiencia y formación. Crítico durante este procedimiento is el manejo de las agujas. La aguja tiene que ser muy delgada para penetrar en la célula sin daño y por lo tanto tiene que ser roto sólo de su punta. Es importante para controlar y medir regularmente el tamaño de la gota durante la inyección para garantizar una inyección uniforme en cada embrión. Cuidadosamente manipula, la aguja se puede utilizar para girar el embrión. Esto es a menudo necesaria para encontrar el blastodisco y el ángulo óptimo de penetración.
La concentración de ADN y ARNm transposasa usada para la inyección es casi seguro que influye en la eficacia de la expresión. Dosis más altas pueden conducir a un aumento de la proporción de células que expresan el transgén pero con mayores concentraciones de ADN (> 50 ng / l) y transposasa mRNA (> 100 ng / l) también se plantea la posibilidad de efectos tóxicos entre los embriones inyectados. Estamos a favor de la utilización de 10 ng / l de ADN y 20 ng / l transposasa mRNA para inyección, que corresponde a 50 pg de ADN de plásmido y 100 pg de ARN por emb inyectadoryo. 100% de los embriones inyectados con estas concentraciones se desarrollan normalmente, y entre 40-70% muestran eGFP-HRAS expresión G12V, después de 4-OHT inducción, dependiendo de la eficacia de la inyección en la celda individual. Entre embriones positivos que normalmente encontramos aproximadamente el 30% que tiene 1-10 clones, el 40% que tiene 10 a 50 clones y el 30% tiene más de 50 clones. Debido a nuestros objetivos de investigación, estamos a favor de la utilización de embriones con menos clones que expresan eGFP-HRAS G12V. Seleccionamos los embriones con 10-50 clones para nuestros experimentos transitorios. Para la generación de los peces fundador transgénico, se recomienda sólo para seleccionar embriones con tanto el marcador cardíaco positivo eGFP y un gran número de clones eGFP-HRAS G12V positivos en sus epidermis.
(Z) -4-hidroxitamoxifeno sufre un cis-trans (EZ) interconversión cuando se expone a la luz 24. Se encontró que el isómero cis (E) es 100 veces menos anti-estrogénica que su contraparte trans 25,26. Exposure a la luz, por lo tanto tiene que ser evitado. La solución madre de 4-OHT disuelto en etanol se puede almacenar a -20 ° C en la oscuridad durante un largo período de tiempo. Se recomienda el uso de una caja para proteger las placas de Petri de la luz durante la inducción de genes diana dentro de la incubadora y el transporte. Aunque el área de la imagen es muy pequeña y la exposición de 4-OHT a la luz UV se reduce a un mínimo, un intercambio constante de solución de inducción cada 2 horas mientras se recomienda de formación de imágenes durante períodos de tiempo más largos para mantener los niveles máximos de expresión. 4-OHT permeabiliza eficazmente a través del corion y las capas más externas de la piel durante la embriogénesis pez cebra, por lo tanto puede inducir la expresión de genes muy rápidamente. Podemos observar fácilmente emisión eGFP después de 2 horas de la inducción y se ha informado de que los primeros signos de la expresión de genes diana pueden ser observados después de 1 hora y la meseta después de 3 horas de tratamiento 8. Las diferencias pueden deberse a la diferente promotor usado en nuestro estudio. Como ha sido previously informó que el 4-OHT tratamiento depende de la dosis 8,27, se optó por utilizar la concentración más alto reportado de 5 M a alcanzar los niveles de expresión robustas y reproducibles en nuestro enfoque transitorio. Esto debería garantizar que todas las células que llevan el transgén se inducir la expresión del gen diana.
Tiene que tenerse en cuenta que el enfoque que aquí se presenta transitoria podría dar lugar a diferentes niveles de expresión debido a la posibilidad de múltiples y aleatorias eventos de inserción del genoma. Además, el uso del ARNm transposasa en el fondo transgénico Tol2 de Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 puede conducir a posibles transposiciones del transgén UAS que podría resultar en el silenciamiento de genes o interrupción. Sin embargo, como el método presentado aquí representa un enfoque transitoria, la pre-selección de embriones posteriores a la inyección es obligatorio. Muchos laboratorios han encontrado que las secuencias UAS tienden a ser silenciado en la descendencia transgénica, por lo tanto, enproyecta la pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP construir en Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embriones podría no ser tan eficaz como la inyección de un UAS construir en Tg (krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ), los embriones. El uso de la línea transgénica estable Tg (krt4: KalTA4-ER T2) cruzó con Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 permitirá un seguimiento preciso de los / apagado en la cinética de la época-dosis activación de genes 4-OHT dependiente .
Un paso crítico durante el montaje de las larvas es la transferencia en la agarosa LMP y sobre la cubierta de vidrio (Figura 1B). Hay solamente un marco de tiempo corto para la temperatura de agarosa LMP líquido que permite una transferencia segura y la orientación de las larvas preseleccionado sin dañar a los peces por cualquiera de choque térmico o endurecimiento del gel. Las larvas debe orientarse directamente sobre la cubierta de vidrio para reducir la distancia de trabajo para el Analy microscópica posteriorsis. Como esto puede ser un factor limitante durante la microscopía de la elección de los objetivos adecuados es obligatorio. Una vez montada, la larva se puede mantener desde horas hasta días.
La condicionalidad del sistema modelo que se presenta en este documento permite la transformación repetida por la activación de 4-OHT del transgén. El sistema de expresión depende de la presencia de 4-OHT y por lo tanto la expresión KalTA4 controlada de un gen de interés es reversible (Figura 1D, b). En contraste con el / Lox sistema Cre-ER T2, lo que facilita un evento de recombinación genómica irreversible 28, KalTA4-ER T2 / UAS puede ser activado y desactivado después de la adición o eliminación de 4-OHT y este potencial para la inducción repetida es una ventaja de la técnica sobre el sistema de T2 / Lox Cre-ER. Sin embargo, el requisito de niveles constantes de 4-OHT es una limitación si el experimento tiene que ser prolongado de días a semanas.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
(Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20°C |
20x Objective | Zeiss | 20x/0,5 Ph2 ∞/0,17 | |
40x Objective | Zeiss | 40x/1,2W Korr ∞/0,14-0,18 | |
63x Objective | Zeiss | 63x/1.4 Oil Ph3 ∞/0,17 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25mm |
Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150 |
Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10mg/μl in water |
Stereoscope | Leica | M80 | |
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |