הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב"מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה
Summary
לומד את האירועים המוקדמים ביותר של התפתחות תא preneoplastic ואינטראקציה תא חיסון מולדת הוא מרכזי להבנה ולטיפול בסרטן. כאן אנו מתארים שיטה לגרום לתנאי תמורות תאי אפיתל והדמית החיה הבאה של אינטראקציה תא חיסון מולדת עם G12V HRAS לבטא בתאי עור בזחלי דג הזברה.
Abstract
Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.
Introduction
צמיחת היתר של צאצאי תא preneoplastic בתוך גיליון אפיתל אחרת נורמלי מאוד תלויה אינטראקציה עם מייקרו-הסביבה שלה. האינטראקציה עם רקמת המארח שלה עשויה להיות הגורם המכריע באם תא preneoplastic הוא מסוגל להקים נישה משובט כדי לפתח עוד יותר לסרטן מפוצץ מלא. למרות חשיבותה בהתפתחות, שלב ראשוני זה של התקדמות הסרטן אינו נגיש במערכות מודל הנפוצות ביותר, in vivo.
דג הזברה, Danio rerio, הוא אורגניזם מודל מבוסס היטב ללימודי הדמיה לחיות בגלל השקיפות שלה בכל התפתחות, האפשרות למניפולציה גנטית, והנגישות לתרופות מסיסות במים. מחקרים שנעשה לאחרונה תוך שימוש במודל דג הזברה זחל, ביתר אונקוגן אדם HRAS G12V להפוך לתאי האפיתל, הראו כי תא מארח נגזר אותות, בH 2 O מסוים יתרון 2 להגיוס של תאים חיסוניים מולדים. מעניין לציין, כי התאים, נויטרופילים ומקרופגים חיסוניים גייסו, הוצגו ליש להם תפקיד בתמיכה תזונתי תא preneoplastic התפשטות 2,3.
כדי להבין את האירועים המוקדמים של התחלה של גידול והתקדמות, כמו גם את התרומה של תגובה דלקתית, אחד צריך להיות מסוגל תמונת האירועים הללו מנקודת הזמן המוקדמת ביותר ואילך. לכן יש צורך לשלוט בשינויי תא באופן ספציפי זמני ורקמות. אנו מנצלים את המערכת / כטב"מ Gal4 שהותאם בהצלחה מ4 תסיסנית להביע תנאי אונקוגן אדם HRAS G12V תחת שליטתו של קרטין אמרגן ספציפי עור 4 (krt4) 5. הגרסה שונה של activator Gal4 תעתיק, כלומר KalTA4 6, מאפשרת ביטוי של HRAS G12V תחת שליטתו של Upstream ההפעלה של הרצף (כטב"מ). תנאים כדי לגרום לביטוי activator תעתיק, KalTA4 כבר התמזג תחום המוטציה מחייב ליגנד של α קולטן אסטרוגן האנושי (T2 ER) 7 אשר נקשר באופן ספציפי 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) 1. בהעדר 4-OHT T2 ER כרוך בציטופלסמה על ידי חלבוני חום-הלם. על 4-OHT מחייב חום-הלם חלבונים לנתק, המאפשר טרנסלוקציה גרעינית של KalTA4-ER T2 והפעלה הבאה של כטב"מ המבוקר גן של עניין 8 (איור 1 ג, ב). כמערכת ביטוי, זה תלויה בנוכחות של 4-OHT, ביטוי KalTA4 המבוקר של גן של עניין הוא הפיך. בניגוד לT2 Cre-ER / המערכת לקס, מה שמוביל לאירוע רקומבינציה בלתי הפיך, האינדוקציה של הפעלת תעתיק ידי KalTA4-ER T2 היא הפיכה על ידי תוספת או גריעה של 4-OHT.
Allo הפרוטוקול הבא ws שינוי מותנה של תאי עור בזחלי דג הזברה וניטור הבא של האינטראקציה עם תאים חיסוניים מולדים על ידי ביטוי חלבון פלואורסצנטי. מתודולוגיות הבסיסיות המועסקות בפרוטוקול זה דומות לכמה טכניקות נפוצות בקהילת דג הזברה 9-13.
הדור ושימוש הקומבינטורית של קווים מהונדסים יחד עם microinjection של מבנים מהונדסים מאפשרים גישה חולפת להפוך רק תאים בודדים באופן פסיפס. חדירות החמצן של עור דג הזברה העוברי וזחל מעלה את האפשרות ללימודי הדמיה לחיות זמן לשגות על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה משעות עד ימים. יתר על כן, נגישותו לתרופות מסיסות במים תאפשר מחקרים מכניסטית עתיד והניטור של אירועים ביולוגיים תא in vivo שעלול להוביל להבנה טובה יותר של השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות הסרטן.
_content "> פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לבצע ביטוי גנים מותנה בכל רקמות של עניין בזחלי דג הזברה, באופן פסיפס. אפשר גם לייעל את מיקרוסקופ הגדרה כדי לחיות תמונת רקמות עמוקות יותר אחרות מאשר עור.Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך embryogenesis ופיתוח זחל, עור דג הזברה העוברי מורכב משתי שכבות אפיתל, periderm נקרא השכבה השטחית ושכבה של קרטינוציטים בסיסיים המחוברים לקרום במרתף הבסיסי 19 (איור 1 ג, א). הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה פשוטה כדי לגרום לשינוי preneoplastic תאים בשכבת העור השטחית של זחלי דג הזברה על תנאי, ומאפשר ניתוח אינטראקציה שלאחר מכן עם תאים חיסוניים מולדים על ידי הדמיה לחיות. מתודולוגיות הבסיסיות בפרוטוקול שלנו לעקוב אחר טכניקות דג הזברה מבוססות היטב 9-13, והפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם בקלות ובשינוי.
אמרגן krt4 5 משמש כאן מניע ביטוי T2 KalTA4-ER במיוחד בשכבת העור החיצונית ביותר (איור 1 ג, ב). עם זאת, המרובה אתרי Gateway מודולרישיבוט אסטרטגיה, המשמשת לייצור krt4: מבנה T2 KalTA4-ER (1D איור,), מספק את האפשרות לשבט כל אמרגן של עניין מול T2 KalTA4-ER בצעד שיבוט יחיד. הסתגלות של השיטה המוצגת במסמך זה ולכן אפשרי עבור רוב הרקמות בעובר ושלבי זחל. הזמינות של רצפי אמרגן היא זאת הגורם המגביל. יתר על כן, כמעט בכל גן של העניין המשובט מאחורי כטב"מ ניתן ביטוי יתר תנאים בשלבי התפתחותיים שונים על ידי שימוש בביטוי T2 KalTA4-ER המרחבית ובזמן בשליטה. לכן, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם כדי לבצע ביטוי גנים מותנה בכל רקמות של עניין בזחלי דג הזברה, באופן פסיפס. אפשר גם לייעל את מיקרוסקופ הגדרה כדי לחיות תמונת רקמות עמוקות יותר כגון כבד או לבלב.
שתארנו יישום אחד תוך שימוש בפרוטוקול שהואמחדש, באופן דומה, ניתן ביטוי יתר מאפנני דלקת אחרים תוך שימוש בפרוטוקול זה כדי ללמוד את הרגולציה של תגובות דלקתיות, כאחד יכול נויטרופילים תמונה בקלות חיים ושינויים התנהגותיים מקרופאג הבא האינדוקציה ומעצרים בביטוי של מאפנן דלקתי מועמד. יתר על כן, הפרוטוקול המותאם יהיה גם מועיל למי שרוצה לעקוב אחר תנועה של תאים ושינוי התנהגות בשלבים שונים של המורפוגנזה רקמה והיווצרות איברים ו, תמונה סוף סוף לחיות את האינטראקציה של אינטראקציות תא חיסון מולדים עם שושלות תאים ספציפיות אחרות שיכולה להיות ממוקדת על ידי מערכת ביטוי T2 / כטב"מ KalTA4-ER מושרה.
השתמשנו וקטור pDestTol2CG מTol2kit דג הזברה 20-23 המכיל cmlc2: eGFP-הרשות הפלסטינית קלטת (1D איור,) המאפשרת בחירה הבאה של עוברים על ידי לב חיובי ניאון ירוק כseסמן lection 20, המפשט את תהליך מיון F0. הכנסה יציבה של גן transposon מוקף עניין לתוך הגנום היא הקלה על ידי הזרקה המשותפת של ה- DNA פלסמיד יחד עם mRNA transposase. ההכנה של ה- DNA פלסמיד וmRNA transposase לmicroinjection כדלקמן פרוטוקולים סטנדרטיים. עם זאת, שילוב מוצלח של המבנה לתוך הגנום תלוי בהעתקה מבוססת Tol2 14. זה מדגיש את תשומת הלב המיוחדת שתשולם לעבודה על קרח בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהומים והשפלות על ידי RNases וDNases. Microinjection לעוברי שלב אחד תא הוא טכניקה חזקה ומבוססת היטב לרווח והפסד של מחקרים לתפקד ב9,10 דג הזברה. למרות שאדם מאומן היטב בקלות יכול להזריק לתוך החלמון של מעל 1,000 עוברים בשעה 1, ההזרקה לblastodisc (איור 1 א, כוכבית) דורשת יותר ניסיון והכשרה. קריטי במהלך הליך זה אניזה הטיפול במחט. המחט צריכה להיות דק מאוד לחדור לתא ללא נזק, ולכן צריכה להיות שנשברה רק על הקצה שלה מאוד. חשוב לשלוט באופן קבוע ולמדוד את גודל הירידה במהלך ההזרקה כדי להבטיח הזרקה אחידה לכל עובר. מטופל בזהירות, את המחט ניתן להשתמש כדי לסובב את העובר. זה נחוץ לעתים קרובות כדי למצוא את blastodisc וזווית החדירה האופטימלית.
הריכוז של mRNA DNA וtransposase המשמש להזרקה כמעט בודאות משפיע על יעילות הביטוי. מינונים גבוהים יותר יכולים להוביל לעליית משקלם של תאים המבטאים את הגן, אבל עם ריכוזים גבוהים יותר של ה- DNA (> 50 ng / μl) וtransposase mRNA (> 100 ng / μl) גם הפוטנציאל להשפעות רעילות בקרב עוברים מוזרקים אינו מתעורר. אנחנו בעד השימוש של 10 ng / μl DNA ו- 20 ng / μl transposase mRNA להזרקה, אשר תואם את 50 pg של פלסמיד דנ"א ורנ"א 100 pg לEMB הזריקryo. של עוברים מוזרקים עם ריכוזים אלה 100% מפתחים בדרך כלל, ובין 40-70% ביטוי G12V תכנית eGFP-HRAS, לאחר אינדוקציה 4-OHT, בהתאם ליעילות ההזרקה לתוך התא הבודד. בין עוברים חיוביים שאנחנו בדרך כלל למצוא כ -30% שיש לי 1-10 שיבוטים, 40% שיש לי 10-50 שיבוטים ו -30% שיש יותר מ 50 שיבוטים. בשל מטרות המחקר שלנו, אנו דוגלים בשימוש בעוברים עם פחות שיבוטים להביע G12V eGFP-HRAS. אנו בוחרים עוברים עם 10-50 שיבוטים לניסויים חולפים שלנו. עבור הדור של דגי מייסד מהונדסים, אנו ממליצים לבחור עוברים עם שני סמן eGFP החיובי הלב ומספר גדול של שיבוטים חיוביים eGFP-HRAS G12V באפידרמיס בלבד.
(Z) -4-Hydroxytamoxifen עובר מרה הדדית cis-טרנס (EZ) כאשר הם נחשפים לאור 24. נמצא כי האיזומר cis (E) הוא 100x אנטי-אסטרוגניים פחות מעמיתו טרנס 25,26. Exposurדואר לאור ולכן יש להימנע. פתרון מניות 4-OHT מומס באתנול ניתן לאחסן ב -20 ° C בחושך על פני תקופה ארוכה. אנו ממליצים על השימוש בתיבה כדי להגן על צלחות פטרי מהאור במהלך האינדוקציה גן המטרה בחממה והתחבורה. למרות שהשטח של הדמיה הוא מאוד קטן וחשיפה של 4-OHT לאור UV מצטמצם למינימום, חליפין קבועים של פתרון אינדוקציה כל 2 שעות בזמן הדמיה פני תקופות זמן ארוכות יותר מומלצת כדי לשמור על רמות ביטוי המרביות. 4-OHT permeabilizes יעילות הדרך סיסית ושכבות העור החיצוניות ביותר בעובר דג הזברה, ולכן זה יכול לגרום לביטוי גנים בקצב מהיר מאוד. אנחנו בקלות יכולות לראות פליטת eGFP לאחר 2 שעות של אינדוקציה וזה כבר דווח כי סימנים הראשונים של ביטוי היעד-גן ניתן לצפות לאחר שעה 1 ורמה לאחר 3 שעות של טיפול 8. ההבדלים יכולים להיות בגלל האמרגן שונה ששמש במחקר שלנו. כיש יחסי ציבור היהדיווחו eviously ש4-OHT טיפול במינון 8,27 תלויים, בחרנו להשתמש בריכוז המדווח הגבוה ביותר של 5 מיקרומטר להשיג רמות ביטוי חזקות ושחזור בגישה החולפת שלנו. זה צריך להבטיח שכל התאים הנושאים את הגן יגרמו לביטוי גן המטרה.
יש לה שיש לקחת בחשבון שהגישה החולפת הציגה כאן עלולה להוביל לרמות ביטוי שונות בשל האפשרות של אירועי החדרת הגנום מרובים ואקראיים. יתר על כן, השימוש בmRNA transposase ברקע המהונדס Tol2 של Tg (כטב"מ: eGFP-HRAS G12V) io006 יכול להוביל לחילופים ופוטנציאל של transgene כטב"מ שעלול לגרום להשתקת גנים או שיבוש. עם זאת, כשיטת המוצגת כאן מייצגת גישה חולפת, המיון המוקדם של עוברים לאחר הזרקה הוא חובה. מעבדות רבות מצאו כי רצפי כטב"מ נוטים להיות מושתקים בצאצאים מהונדסים, ומכאן בjecting pTol2-krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: eGFP לבנות לתוך Tg (כטב"מ: eGFP-HRAS G12V) io006 עוברים לא יכול להיות יעיל כמו הזרקת כטב"מ לבנות לתוך Tg (krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: GFP עוברים). השימוש בקו המהונדס היציב Tg (krt4: T2 KalTA4-ER) חצה עם Tg (כטב"מ: eGFP-HRAS G12V) io006 יאפשר ניטור מדויק של קינטיקה / כיבוי של זמן מינון הפעלת גן 4-OHT תלוי .
צעד קריטי במהלך ההרכבה של זחלים הוא ההעברה לagarose LMP ועל מכסה הזכוכית (איור 1). יש רק פרק זמן קצר לטמפרטורת agarose LMP נוזלית המאפשר העברה וכיוון בטוחה של הזחלים שנבחרו מראש מבלי לפגוע בדגים או על ידי הלם חום או התקשות של ג'ל. הזחלים צריכים להיות מכוון ישירות על גבי מכסה הזכוכית כדי לצמצם את מרחק העבודה לanaly המיקרוסקופי שלאחר מכןsis. כמו זה יכול להיות גורם מגביל במיקרוסקופיה בחירת המטרות המתאימות היא חובה. ברגע שעלה, הזחל יכול להישמר משעות עד ימים.
ההתניה של מערכת המודל שהוצגה במסמך זה מאפשרת לשינוי חוזר ונשנה של הפעלת 4-OHT של transgene. מערכת הביטוי תלויה בנוכחות של 4-OHT ולכן ביטוי KalTA4 המבוקר של גן של עניין הוא הפיך (1D איור, ב). בניגוד לT2 Cre-ER / המערכת לקס, המאפשרת אירוע רקומבינציה הגנומי בלתי הפיך 28, יכול להיות מופעל על KalTA4-ER T2 / כטב"מ ומנוטרל על תוספת או גריעה של 4-OHT ופוטנציאל זה לזירוז חוזר ונשנה הוא יתרון של הטכניקה מעל T2 המערכת / קס Cre-ER. עם זאת, הדרישה לרמות קבועות של 4-OHT היא מגבלה אם הניסוי צריך להיות ממושך מימים עד שבועות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20°C |
| 20x Objective | Zeiss | 20x/0,5 Ph2 ∞/0,17 | |
| 40x Objective | Zeiss | 40x/1,2W Korr ∞/0,14-0,18 | |
| 63x Objective | Zeiss | 63x/1.4 Oil Ph3 ∞/0,17 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
| Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25mm |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
| Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150 |
| Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
| Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
| pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10mg/μl in water |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
| Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
| Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |
References
- Kajita, M., Sugimura, K., et al. Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells. Nature communications. 5, 4428 (2014).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), e1000562 (2010).
- Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2. Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).
- Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Gong, Z., Ju, B., et al. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).
- Gerety, S. S., Breau, M. a., Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. An inducible transgene expression system for zebrafish and chick. Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. Trapping Using Gal4 in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).
- Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genetics. 2 (11), e169 (2006).
- Santoriello, C., Gennaro, E., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PloS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- . MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit. Protocols and Product Manuals. 12537-023, (2010).
- Petersen, L. K., Stowers, R. S. A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit). PLoS ONE. 6 (9), e10 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).
- Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form. The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).
- Murphy, C., Langan-Fahey, S. Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro. Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).
- Furr, B. J. A., Jordan, V. C. The pharmacology and clinical uses of tamoxifen. Pharmacology & Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).
- Akerberg, A. a., Stewart, S., Stankunas, K. Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish. PloS One. 9 (3), e92217 (2014).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish. PloS One. 4 (2), e4640 (2009).
