Het bestuderen van de vroegste gebeurtenissen van preneoplastische cel progressie en aangeboren immuunsysteem interactie cel is cruciaal om te begrijpen en behandelen van kanker. Hier beschrijven we een methode om epitheelcellen transformaties en de daaropvolgende live beeldvorming van aangeboren immuunsysteem interactie cel met HRAS G12V uiten huidcellen in de zebravis larven voorwaardelijk induceren.
Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.
De begroeiing van een pre-neoplastische cel nageslacht binnen een overigens normale epitheliale blad is sterk afhankelijk van een interactie met de micro-omgeving. De interactie met gastheerweefsel is waarschijnlijk de belangrijkste determinant of een pre-neoplastische cel kan een klonale niche verder ontwikkelen tot een volledige geblazen kanker vast te stellen. Ondanks het belang in ontwikkeling, deze eerste fase van kanker progressie ontoegankelijk meest gebruikte modelsystemen in vivo.
De zebravis, Danio rerio, is een gevestigde modelorganisme voor live-imaging studies vanwege de transparantie in de ontwikkeling, de mogelijkheid tot genetische manipulatie, en toegankelijkheid voor wateroplosbare geneesmiddelen. Recente studies met een larvale zebravis model overexpressie menselijke oncogen HRAS G12V epitheelcellen transformeren bleek dat gastheercel afgeleide signalen, met name H 2 O 2 voorsprongde werving van aangeboren immuunsysteem cellen. Interessant is dat de aangeworven immuuncellen, neutrofielen en macrofagen, werden naar een trofische rol in de ondersteuning preneoplastische celproliferatie 2,3 hebben.
Om de vroege gebeurtenissen van tumor initiatie en progressie en de bijdrage van een ontstekingsreactie begrijpen, moet men kunnen beeld deze gebeurtenissen vanaf het vroegste tijdstip vanaf. Daarom is het noodzakelijk om de cel transformaties regelen in een tijdelijke en weefsel specifieke manier. Wij gebruiken de Gal4 / UAS systeem met succes aangepast van Drosophila 4 voorwaardelijk drukken de menselijke oncogen HRAS G12V onder controle van de huid specifieke promotor keratine 4 (krt4) 5. De gewijzigde versie van de transcriptionele activator GAL4 namelijk KalTA4 6, maakt expressie van HRAS G12V onder de controle van de Upstream Activating Sequence (UAS). De transcriptionele activator uitdrukking voorwaardelijk induceren, is KalTA4 gefuseerd aan het mutante ligand bindende domein van de humane oestrogeen receptor α (ER T2) 7 die specifiek 4-hydroxytamoxifen bindt (4-OHT) 1. Aangezien 4-OHT het ER T2 is gebonden in het cytoplasma door warmte-shock eiwitten. Bij 4-OHT binding warmte-shock eiwitten dissociëren, waardoor een nucleaire translocatie van KalTA4-ER T2 en daaropvolgende activatie van de UAS gecontroleerde gen van belang 8 (figuur 1C, b). Aangezien dit expressiesysteem afhankelijk van de aanwezigheid van 4-OHT, de KalTA4 gecontroleerde expressie van een gen van belang is omkeerbaar. In tegenstelling tot de Cre-ER T2 / Lox-systeem, hetgeen leidt tot een onomkeerbare recombinatie gebeurtenis, de inductie van transcriptionele activatie door KalTA4-ER T2 is omkeerbaar door toevoeging of verwijdering van 4-OHT.
Het volgende protocol allo ws een voorwaardelijke transformatie van de huidcellen in de zebravis larven en een daaropvolgende controle van de interactie met aangeboren immuunsysteem cellen door fluorescerend eiwit expressie. Basistechnieken voor het werkzaam zijn in dit protocol zijn vergelijkbaar met een aantal veel gebruikte technieken binnen de zebravis gemeenschap 9-13.
De opwekking en combinatorische gebruik van transgene lijnen met de micro-injectie van transgene constructen kan een voorbijgaande benadering slechts enkele cellen te transformeren in een mozaïek wijze. De zuurstofdoorlaatbaarheid van de embryonale en larvale zebravis huid verhoogt de mogelijkheid voor time-lapse live beeldvorming studies van hoge-resolutie microscopie van uren tot dagen. Voorts zal de toegankelijkheid tot wateroplosbare geneesmiddelen toekomstige mechanistische studies en de controle cel biologische gebeurtenissen die in vivo kan leiden tot een beter begrip van de beginfase van de kanker mogelijk.
_content "> Dit protocol kan worden aangepast aan conditionele genexpressie verrichten in alle weefsels van interesse zebravis larven in een mozaïek wijze. Men kan ook optimaliseren microscoop instelling om beeld uitzondering skin diepere weefsels leven.Tijdens embryogenese en larvale ontwikkeling, de embryonale zebravis huid uit twee epitheliale lagen, de oppervlakkige laag die periderm en een laag van basale keratinocyten die zijn bevestigd aan de onderliggende basaalmembraan 19 (figuur 1C, a). De hier gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige methode om voorwaardelijk induceren preneoplastische-cel transformatie in de oppervlakkige huidlaag van de zebravis larven, en zorgt voor verdere interactie-analyse met aangeboren immuunsysteem cellen door live beeldvorming. De basistechnieken in ons protocol volgen goed gevestigde technieken zebravis 9-13 en ons protocol kan gemakkelijk worden aangepast en gewijzigd.
De krt4 promotor 5 hier gebruikt drijft KalTA4-ER T2 expressie specifiek in de buitenste huidlaag (figuur 1C, b). Echter, de modulaire MultiSite Gatewayklonen strategie gebruikt voor het genereren krt4: KalTA4-ER T2 construct (Figuur 1D, a), verschaft de mogelijkheid om eventuele promotor van belang voor KalTA4-ER T2 klonen in één kloneringsstap. Een aanpassing van de hierin voorgestelde werkwijze Daarom kan de meeste weefsels tijdens de embryonale en larvale stadia. De beschikbaarheid van promotorsequenties wordt hierbij de beperkende factor. Bovendien kan vrijwel elk gen van interesse gekloneerd achter een UAS voorwaardelijk overexpressie in verschillende ontwikkelingsstadia door gebruik van de ruimtelijke en temporeel gereguleerde KalTA4-ER T2 expressie. Daarom kunnen ons protocol worden aangepast aan conditionele genexpressie verrichten in alle weefsels van interesse zebravis larven in een mozaïek wijze. Men kan ook het optimaliseren van de microscoop instelling in om het imago van diepere weefsels zoals de lever of alvleesklier leven.
We hebben een applicatie met behulp van het protocol hij beschreefopnieuw, op dezelfde wijze, kan men andere ontstekingsmodulatoren een overexpressie van het gebruik van dit protocol om de regulering van ontstekingsreacties te bestuderen, zo kan men gemakkelijk livebeeld neutrofielen en macrofagen gedragsveranderingen na de inductie en de arrestatie in de expressie van een kandidaat-inflammatoire modulator. Bovendien zou het aangepaste protocol ook gunstig voor degenen die willen naar cel beweging en gedragsverandering te sporen tijdens de verschillende fasen van weefsel morfogenese en orgel vorming en zijn, eindelijk live-beeld van de interactie van aangeboren immuunsysteem cel interacties met andere specifieke cellijnen die kunnen worden gericht de induceerbare KalTA4-ER T2 / UAS expressiesysteem.
We gebruikten de pDestTol2CG vector van de zebravis Tol2kit 20-23 dat een cmlc2 bevat: eGFP-pA cassette (figuur 1D, a), die de daaropvolgende selectie van embryo's mogelijk maakt door groen fluorescerend positieve harten als een selection marker 20 dat de F0 screening proces vereenvoudigt. Een stabiele insertie van het transposon geflankeerd gen van interesse in het genoom wordt vergemakkelijkt door co-injectie van plasmide-DNA met transposase mRNA. De bereiding van plasmide-DNA en het transposase mRNA microinjectie volgt standaardprotocollen. Echter, een succesvolle integratie van het construct in het genoom afhankelijk van de Tol2 gebaseerde omzetting 14. Dit wijst op de bijzondere aandacht te worden besteed aan het werk op het ijs onder steriele omstandigheden om verontreinigingen en degradaties vermijden door RNases en DNasen. Micro-injectie in een-cellig stadium embryo's is een robuuste en gevestigde techniek voor winst en verlies van functie studies in zebravis 9,10. Hoewel een goed opgeleide persoon gemakkelijk kan injecteren in de dooier van meer dan 1.000 embryo's in 1 uur, de injectie in de blastodiscus (Figuur 1A, sterretje) vereist meer ervaring en opleiding. Kritische tijdens deze procedure is de afhandeling van de naald. De naald heeft een zeer dun om de cel zonder schade door te dringen te zijn en daarom moet worden doorbroken alleen op zijn uiterste puntje. Het is belangrijk om regelmatig controleren en meten van de druppelgrootte tijdens de injectie om een uniforme injectie garanderen in elk embryo. Zorgvuldig behandeld, de naald kan worden gebruikt om de embryo draaien. Dit is vaak nodig om de blastodiscus en de optimale penetratie hoek vinden.
De concentratie van DNA en transposase mRNA gebruikt voor injectie vrijwel zeker beïnvloedt de expressie efficiency. Hogere doses kunnen leiden tot een verhoogde verhouding van cellen die het transgen maar met hogere concentraties DNA (> 50 ng / ul) en transposase mRNA (> 100 ng / ul) ook het potentieel voor toxische effecten bij geïnjecteerde embryo niet voordoet. We geven de voorkeur 10 ng / ul DNA en 20 ng / ul transposase mRNA voor injectie, overeenkomend met 50 pg van plasmide-DNA en 100 pg RNA per geïnjecteerde embryo. 100% van de embryo's geïnjecteerd met deze Concentraties normaal ontwikkelen en 40-70% vertonen eGFP-HRAS G12V expressie na 4-OHT inductie afhankelijk van de injectierendement in de cel. Onder positieve embryo we normaal voorbeeld ongeveer 30% die 1-10 klonen, 40% dat 10-50 klonen en 30% met meer dan 50 klonen. Door onze onderzoeksdoelen, geven wij de voorkeur het gebruik van embryo's met minder klonen die eGFP-HRAS G12V. Wij selecteren embryo's met 10-50 klonen voor onze voorbijgaande experimenten. Voor het genereren van transgene oprichter vis, raden we aan om alleen te selecteren embryo's met zowel de eGFP positieve cardiale marker en een groot aantal eGFP-HRAS G12V positieve klonen in hun opperhuid.
(Z) -4-hydroxytamoxifen ondergaat een cis-trans (EZ) interconversie bij blootstelling aan licht 24. Gevonden werd dat de cis-isomeer (E) 100x minder anti-oestrogene dan zijn tegenhanger trans 25,26. BELICHTIe licht moet derhalve worden vermeden. De 4-OHT voorraadoplossing opgelost in ethanol bij -20 ° C worden bewaard in het donker gedurende een lange periode. Wij raden het gebruik van een doos om de petrischaaltjes bescherming tegen licht tijdens doel geninductie binnen de incubator en transport. Hoewel het gebied van beeldvorming is zeer klein en blootstelling van 4-OHT UV licht tot een minimum, een voortdurende uitwisseling van inductie oplossing om de 2 uur onder beeldvorming over langere perioden wordt aanbevolen maximale expressieniveaus handhaven. 4-OHT effectief permeabilizes door het chorion en de buitenste huidlagen tijdens zebravis embryogenese, daarom kan het genexpressie zeer snel te induceren. We kunnen gemakkelijk waarnemen eGFP emissie na 2 uur van inductie en er is gemeld dat eerste tekenen van target-genexpressie kan worden waargenomen na 1 uur en plateau na 3 uur behandeling 8. De verschillen kunnen het gevolg zijn van de verschillende promoter gebruikt in onze studie. Zoals reeds previously gemeld dat 4-OHT behandeling is afhankelijk van de dosis 8,27, hebben we ervoor gekozen om de hoogste gemelde concentratie van 5 uM gebruiken om robuuste en reproduceerbare expressie niveaus in onze voorbijgaande aanpak. Dit moet waarborgen dat alle cellen die het transgen doelwitgen expressie induceren.
Het heeft het feit dat de tijdelijke benadering hier gepresenteerde kan leiden tot variërende expressieniveaus worden genomen door de mogelijkheid van meervoudige genoom en willekeurige insertie gebeurtenissen. Bovendien is het gebruik van het transposase mRNA in de Tol2 transgene achtergrond van Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 kan leiden tot mogelijke omzetting van de UAS transgen die kunnen resulteren in gen-silencing of verstoring. Aangezien de hier gepresenteerde methode vertegenwoordigt een voorbijgaande benadering de voorselectie van embryo na injectie verplicht. Veel laboratoria hebben ontdekt dat UAS sequenties hebben de neiging om worden uitgezet in de transgene nakomelingen, vandaar injecting de pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP construct in Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embryo's misschien niet zo efficiënt als het injecteren van een UAS-construct in Tg (krt4 zijn: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ) embryo's. Het gebruik van de stabiele transgene lijn Tg (krt4: KalTA4-ER T2) gekruist met Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 zal een nauwkeurige controle van de aan / uit-kinetiek van de time-dosering afhankelijk 4-OHT genactivatie toestaan .
Een cruciale stap tijdens de montage van de larven is de overdracht in de LMP agarose en op de dekking van glas (Figuur 1B). Er is slechts een kort tijdsbestek voor vloeibare LMP agarose temperatuur die een veilige overdracht en oriëntatie van de voorgeselecteerde larven toelaat zonder nadelige gevolgen voor de vissen door een heat shock of verharding van de gel. De larven moeten direct worden gericht op de dekking van glas om de werkafstand te verminderen voor de daarop volgende microscopisch analysis. Aangezien dit een beperkende factor kan zijn tijdens microscopie de keuze van passende doelstellingen verplicht. Eenmaal gemonteerd, kan de larve worden gehandhaafd van uren tot dagen.
De voorwaarden van het modelsysteem hierin gepresenteerd zorgt voor herhaalde transformatie door 4-OHT activering van het transgen. Het expressiesysteem afhankelijk van de aanwezigheid van 4-OHT en daarom KalTA4 gereguleerde expressie van een gen van belang is omkeerbaar (figuur 1D, b). In tegenstelling tot de Cre-ER T2 / Lox-systeem, dat een onomkeerbare genomische recombinatie 28 vergemakkelijkt, kan KalTA4-ER T2 / UAS wordt geactiveerd en gedeactiveerd na toevoeging of verwijdering van 4-OHT en dit potentieel voor herhaalde inductie is een voordeel van de techniek via Cre-ER T2 / Lox systeem. De eis voor een constant niveau 4-OHT een beperking wanneer de proef moet worden verlengd van dagen tot weken.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
(Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20°C |
20x Objective | Zeiss | 20x/0,5 Ph2 ∞/0,17 | |
40x Objective | Zeiss | 40x/1,2W Korr ∞/0,14-0,18 | |
63x Objective | Zeiss | 63x/1.4 Oil Ph3 ∞/0,17 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25mm |
Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150 |
Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10mg/μl in water |
Stereoscope | Leica | M80 | |
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |