幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

胚及び幼虫の発育中に、ゼブラフィッシュ胚の皮膚は2つの上皮層からなる表面層と呼ばれる周皮とその下の基底膜¹⁹に取り付けられている基底ケラチノサイトの層（ 図1C、a）である 。ここに提示されたプロトコルは、条件付きゼブラフィッシュ幼虫の表皮層における前新生物細胞の形質転換を誘導するための簡単​​な方法を記載し、ライブイメージングによる自然免疫細胞とのその後の相互作用の分析を可能にする。私たちのプロトコルの基本的な方法論は、十分に確立されたゼブラフィッシュのテクニック⁹従う^{– 13、}そして私たちのプロトコルが容易に適合し、変更することができます。

ここで使用krt4プロモーター ^5が最も外側の表皮層（ 図1C、B）で特異的にKalTA4-ER ^T2が発現を駆動する。しかし、モジュラーマルチサイトゲートウェイkrt4を生成するために使用されるクローニング戦略：KalTA4-ER ^T2の^構築物（ 図1D、a）が 、単一のクローニング工程でKalTA4-ER ^T2の前に興味のある任意のプロモーターをクローン化する可能性を提供する。ここに提示された方法の適応は、胚形成および幼虫の段階でほとんどの組織のためのことが可能である。プロモーター配列の利用可能性は、本明細書制限要因である。さらに、UASの後ろにクローン化された興味のあるほとんどすべての遺伝子は、条件付きで、空間と時間的に制御KalTA4-ER ^T2の^表現を使用することによって異なる発生段階で過剰発現させることができる。したがって、我々のプロトコルは、モザイク状に、ゼブラフィッシュの幼生において任意の目的の組織における遺伝子発現の条件を実行するように適合させることができる。一つは、また、肝臓や膵臓などの画像より深い組織を生きるために、設定を顕微鏡を最適化することができます。

我々は、彼プロトコルを使用して一つのアプリケーションを記載している再、同様に、1は1つが、画像中球と候補炎症調節因子の発現の誘導と逮捕、次のマクロファージ行動の変化を簡単に生きることができるように、炎症反応の調節を研究するためにこのプロトコルを使用して他の炎症調節因子を過剰発現することができます。さらに、適合したプロトコルも標的とすることができる他の特定の細胞系統と、自然免疫細胞の相互作用の相互作用、組織の形態形成や器官形成の異なる段階の間、細胞運動や行動変化をトレースしたい人と、最終的には、ライブ画像のために有益であろう誘導性KalTA4-ER ^T2 / UAS発現系による。

SEとして緑色蛍光陽性の心によって胚のその後の選択を可能にする（A、図1D） のeGFP-PAカセット：cmlc2が含まれている^{23 –}私たちは、ゼブラフィッシュTol2kit ²⁰からpDestTol2CGベクトルを使用F0スクリーニングプロセスを簡素化lectionマーカ^20。ゲノムへの関心のトランスポゾン隣接した遺伝子の安定な挿入は、トランスポザーゼmRNAと一緒に、プラスミドDNAの共注射により促進される。マイクロインジェクションのためのプラスミドDNAとトランスポザーゼmRNAの調製は、標準的なプロトコールに従う。しかし、ゲノムへの構築物の統合の成功はTol2のベースの転置¹⁴に依存します。これはRNアーゼおよびDNアーゼによる汚染や劣化を避けるために、無菌条件下で氷の上で動作するように支払われる特別の注意を強調しています。 1細胞期胚へのマイクロインジェクションは、ゼブラフィッシュ^9,10における機能研究のゲインと損失のための堅牢で十分に確立された技術である。よく訓練された人は簡単に1時間で1,000人以上の胚の卵黄に注入することができますが、胚盤（ 図1A、アスタリスク）への注入は、より多くの経験と訓練が必要です。この手順の間に重要な私針の取り扱いがね。針が損傷することなく細胞に浸透することが非常に薄くなければならないので、唯一の非常にチップを破壊する必要がある。これは、定期的に制御し、各胚に均一な注入を保証するために、注入中に液滴サイズを測定することが重要である。慎重に処理、針が胚を回転させるために使用することができる。これは、多くの場合、胚盤と最適普及角度を見つけるために必要とされる。

ほぼ確実に注射のために使用したDNAとトランスポザーゼmRNAの濃度は、発現効率に影響する。より高用量は、導入遺伝子を発現する細胞の割合が増加するが、DNAのより高い濃度（> 50 ng /μLで）でリードしたmRNA（> 100 ng /μLで）また、注入した胚の中で毒性作用の可能性が発生しないがトランスポザーゼができます。私たちは、10 ng /μLでDNAとプラスミドDNAの50 PGと注入されたEMBあたりのRNAの100 PGに対応して注入するための20 ng /μLでトランスポゼースmRNAの使用を好む亮。これらの濃度を注入した胚の100％が、単一の細胞内への注入効率に応じて、4-OHTの誘導後、正常に発達し、40〜70％の間ショーのeGFP-HRASの^G12V式でください。正の胚の中で、我々は、通常、1〜10個のクローンを有し、約30％、10〜50個のクローンと、50以上のクローンを有する30％、40％を見つける。起因する我々の研究の目的のために、我々はeGFPの-HRAS ^G12Vを発現している少数のクローンと胚の使用を好む。私たちは、一過性の実験のために10〜50個のクローンを持つ胚を選択します。トランスジェニック創始魚の世代のために、我々は唯一のEGFP陽性心臓マーカーとその表皮におけるEGFP-HRAS ^G12V陽性クローン多数の両方を持つ胚を選択することをお勧めします。

光²⁴にさらされると（Z）-4-ヒドロキシタモキシフェンは、シス-トランス（EZ）の相互変換を受ける。これは、シス異性体（E）は、そのトランス対応^25,26より100倍少ない抗エストロゲンであることが見出された。 Exposurしたがって、点灯する電子は避けなければならない。エタノールに溶解した4-OHTのストック溶液は、長い時間にわたって暗所に-20℃で保存することができる。私たちは、インキュベーターや輸送中の標的遺伝子誘導の間に光からペトリ皿を保護するためのボックスを使用することをお勧めします。イメージングの領域であるが、より長い期間にわたって撮影が最大発現レベルを維持することが推奨されている間2時間毎に非常に小さく、UV光に4-OHTの露出は最小限に抑えられ、誘導溶液の為替。 4-OHTを効果的にゼブラフィッシュ胚発生の間に絨毛膜および最も外側の皮膚層を介して透過性に、したがって、それは非常に迅速に遺伝子発現を誘導することができる。我々は容易に誘 ​​導の2時間後のeGFP発光を観察することができ、標的遺伝子発現の最初の兆候は、治療⁸の3時間後、1時間後にプラトーに観察することができることが報告されている。違いは、私たちの研究で用いた異なるプロモーターによるものである可能性があります。き広報を有するものeviously 4-OHT処理は用量依存^8,27であることを報告し、私たちは、過渡的なアプローチで、堅牢で再現性の発現レベルを達成するために5μmの最高報告濃度を使用することにしました。これは、導入遺伝子を保有する全ての細胞が、標的遺伝子の発現を誘導することを保証すべきである。

それにより、複数のランダムなゲノム挿入事象の可能性をここに提示過渡的なアプローチは、様々な発現レベルにつながる可能性があることを考慮に入れなければならない。また、Tgは（UAS：eGFPを-HRAS ^G12V）のTol2のトランスジェニックバックグラウンドでトランスポゼースmRNAの使用がio006は、遺伝子サイレンシングまたは混乱の原因となりUAS導入遺伝子の潜在的な転位につながることができます。ここで紹介する方法は、過渡的なアプローチを表ししかし、注入後の胚の事前選択は必須です。多くのラボでは、UAS配列が故にで、トランスジェニック子孫に沈黙される傾向があることを見出したcmlc2は、KalTA4-ERの^T2：：eGFPをは（UAS：eGFPを-HRAS ^G12V）のTgに構築io006胚はTgのへの構築UASを注入するほど効率的ではないかもしれません（krt4：KalTA4-ER ^T2は 、cmlc2：pTol2-krt4をjecting GFP ）の胚。安定したトランスジェニック線 TGの使用時間に用量依存4-OHTの遺伝子活性化のオン/オフ反応速度の正確なモニタリングが可能になりますio006（krt4：KalTA4-ER ^T2が ）のTg（EGFP-HRAS ^G12V UAS）と交配。

幼虫の実装時の重要なステップは、LMPアガロースへとカバーガラス（ 図1B）に転写される。いずれかの熱ショックによって魚を傷つけるまたはゲルが硬化することなく、予め選択された幼虫の安全な転送および配向を可能にする液体LMPアガロース温度短期間のみ存在する。幼虫は、その後顕微鏡ANALYための作動距離を減少させるためにカバーガラス上に直接配向されるべきであるSIS。これは、顕微鏡の間に制限する要因となり得るように、適切な目標の選択が必須です。一度マウントされ、幼虫は数時間から数日を維持することができる。

本明細書で提示モデル系のコンディショナリティは、導入遺伝子の4-OHTの活性化によって繰り返し変換することができます。発現系は、4-OHTの存在に依存するため、目的とする遺伝子のKalTA4制御された発現（ 図1D、b）は、可逆的である。不可逆的なゲノム組換え事象^28を容易にCre-ER ^T2 / Lox系とは対照的に、KalTA4-ER ^T2 / UASは、活性化非アクティブ4-OHTの追加または除去の際に繰り返し誘導のためのこの可能性は、利点であることができるのCre-ER ^T2 / Lox系オーバー技法。実験は、数日から数週間から延長する必要がある場合は、4-OHTの一定のレベルの要件は制限がある。