Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Durante a embriogénese e desenvolvimento das larvas, a pele de peixe-zebra embrionários é composto de duas camadas epiteliais, a camada superficial chamado periderme e uma camada de queratinócitos basais que estão ligadas à membrana basal subjacente ¹⁹ (Figura 1C, a). O protocolo aqui apresentado descreve um método simples para induzir a transformação em células condicionalmente pr�neopl�ica na camada superficial da pele de larvas de peixe-zebra, e permite a análise subsequente interacção com células do sistema imune inato de imagens em tempo real. As metodologias base no nosso protocolo de seguir as técnicas bem estabelecidas de peixe-zebra ^9-13, e nosso protocolo pode ser facilmente adaptado e modificado.

O promotor utilizado aqui krt4 ⁵ dirige-ER KalTA4 expressão ^T2 especificamente na camada mais externa da pele (Figura 1C, b). No entanto, o gateway modulares MultiSiteestratégia de clonagem, utilizado para gerar o krt4: KalTA4-ER ^T2 construção (Figura 1D, a), fornece a possibilidade de clonar qualquer promotor de interesse em frente de KalTA4-ER ^T2 num único passo de clonagem. Uma adaptação do método aqui apresentado é portanto possível para a maioria dos tecidos durante a embriogénese e estádios larvares. A disponibilidade de sequências de promotor é instituído o fator limitante. Além disso, quase qualquer gene de interesse clonado atrás de uma UAS pode ser condicionalmente superexpresso em diferentes estágios de desenvolvimento pela utilização da expressão KalTA4-ER ^T2 espacial e temporalmente controlada. Por isso, o nosso protocolo pode ser adaptado para realizar a expressão génica condicional em qualquer tecido de interesse em larvas do peixe, de um modo mosaico. Pode-se também otimizar a configuração, a fim de viver imagem tecidos mais profundos, como o fígado ou pâncreas microscópio.

Nós descrevemos um aplicativo usando o protocolo queRe, da mesma forma, pode-se overexpress outros moduladores da inflamação usando esse protocolo para estudar a regulação das respostas inflamatórias, como se pode facilmente neutrófilos imagem ao vivo e mudanças comportamentais de macrófagos após a indução e parada na expressão de um modulador inflamatória candidato. Além disso, o protocolo adaptado também seria benéfico para aqueles que querem rastrear o movimento celular e mudança de comportamento durante as diferentes fases da morfogênese do tecido e formação de órgãos e, finalmente, imagem ao vivo da interação de interações entre células da imunidade inata com outras linhagens de células específicas que podem ser direcionados pelo KalTA4-ER sistema de expressão de ^T2 / UAS indutível.

Utilizou-se o vector pDestTol2CG do Tol2kit zebrafish ^20-23 que contém um cmlc2: eGFP-PA cassete (Figura 1D, a) que permite posterior seleção de embriões por corações positivos fluorescentes verdes como selection marcador ^20, que simplifica o processo de triagem F0. Uma inserção estável do gene de interesse ladeado transposão no genoma é facilitada pela co-injecção do ADN de plasmídeo em conjunto com ARNm de transposase. A preparação de DNA de plasmídeo e o ARNm da transposase para microinjecção segue protocolos convencionais. No entanto, uma integração bem sucedida da construção no genoma depende da transposição baseadas ^Tol2-14. Isso destaca a atenção especial a ser pago para trabalhar no gelo em condições estéreis para evitar contaminações e degradações por RNases e DNases. Microinjeção em embriões em estágio de uma célula é uma técnica robusta e bem estabelecida para o ganho e perda de estudos da função em ^9,10 peixe-zebra. Embora uma pessoa bem treinada pode facilmente injetar na gema de mais de 1.000 embriões em 1 hr, a injecção no blastodisc (Figura 1A, asterisco) requer mais experiência e formação. Critical durante este procedimento is o manuseamento da agulha. A agulha tem que ser muito fino para penetrar na célula sem danos e, portanto, tem de ser quebrado apenas em sua ponta. É importante para controlar regularmente e medir o tamanho de gota durante a injecção para garantir uma injecção uniforme em cada embrião. Manuseados com cuidado, a agulha pode ser usado para rodar o embrião. Isso é muitas vezes necessário para encontrar o blastodisc e o ângulo de penetração ideal.

A concentração de ADN e ARNm de transposase utilizado para injecção quase certamente influencia a eficiência de expressão. Doses mais elevadas podem conduzir a um aumento da proporção de células que expressam o transgene, mas com concentrações mais altas de ADN (> 50 ng / mL) e o ARNm da transposase (> 100 ng / mL), também o potencial de efeitos tóxicos entre os embriões injectados se coloca. Nós favorecer a utilização de 10 ng / mL de ADN e 20 ng / ul transposase ARNm para injecção, o que corresponde a 50 pg de ADN plasmídico e 100 ug de ARN por emb injectadoRyo. 100% dos embriões injectados com estas concentrações não se desenvolvem normalmente, entre 40-70% e mostra eGFP-HRAS expressão ^G12V, após a indução de 4-OHT, dependendo da eficiência injecção no única célula. Entre embriões positivos que normalmente encontrar cerca de 30% que têm 10/01 clones, 40% que têm 10-50 clones e 30% com mais de 50 clones. Devido aos nossos objetivos de pesquisa, somos a favor da utilização de embriões com poucos clones expressando eGFP-HRAS ^G12V. Nós selecionar embriões com 10-50 clones para nossos experimentos transitórios. Para a geração de peixe transgênico fundador, recomendamos que só selecionar embriões com tanto o marcador cardíaco positivo eGFP e um grande número de clones positivos eGFP-HRAS ^G12V em sua epiderme.

(Z) -4-hidroxitamoxifeno sofre uma interconversão cis-trans (EZ) quando exposto à luz ^24. Verificou-se que o isómero cis (E) é 100x menos anti-estrogénica do que a sua contraparte trans ^25,26. Exposure à luz, por conseguinte, tem de ser evitado. A solução stock de 4-OHT dissolvido em etanol podem ser armazenadas a -20 ° C no escuro durante um período de tempo longo. Recomendamos o uso de uma caixa para proteger as placas de Petri da luz durante a indução do gene alvo dentro da incubadora e transporte. Embora a área da imagem é muito pequeno e de exposição de 4-OHT para luz UV é reduzida a um mínimo, uma troca constante de solução de indução a cada 2 horas enquanto a imagem ao longo de períodos de tempo mais longos é recomendado para manter os níveis máximos de expressão. 4-OHT permeabiliza efetivamente através do córion e as camadas mais externas da pele durante a embriogênese peixe-zebra, portanto, pode induzir a expressão do gene muito rapidamente. Nós podemos facilmente observar emissão eGFP após 2 horas de indução e foi relatado que os primeiros sinais de expressão do gene-alvo pode ser observada após 1 hora e 3 horas depois de patamar de tratamento ^8. As diferenças podem ser devido ao diferente promotor utilizado no nosso estudo. Como tem sido previously informou que 4-OHT tratamento é dependente da dose ^8,27, optamos por utilizar a maior concentração relatada de 5 mM para alcançar robustas e reproduzíveis níveis de expressão em nossa abordagem transitória. Isto deveria garantir que todas as células que transportam o transgene irá induzir a expressão do gene alvo.

Tem que ser tido em conta que a abordagem transiente aqui apresentada poderia conduzir a diferentes níveis de expressão, devido à possibilidade de múltiplos eventos de inserção aleatória e genoma. Além disso, a utilização do ARNm da transposase no fundo transgénico Tol2 de Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 pode levar a possíveis transposições do transgene UAS que poderia resultar no silenciamento de genes ou perturbação. No entanto, como o método aqui apresentado representa uma abordagem transiente, a pré-selecção de embriões subsequentes à injecção é obrigatória. Muitos laboratórios descobriram que as sequências UAS tendem a ser silenciados na prole transgênica, portanto, emjecting o pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP construir em Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 embriões pode não ser tão eficiente quanto a injeção de um UAS construir em Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: GFP ) embriões. O uso da linhagem transgênica estável Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2) cruzados com Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 permitirá um acompanhamento preciso das on / off cinética do tempo-dependente de dosagem ativação do gene 4-OHT .

Um passo crítico durante a montagem das larvas é a transferência para a agarose LMP e sobre a tampa de vidro (Figura 1B). Existe apenas um curto espaço de tempo para LMP agarose de temperatura de líquido que permite a transferência segura e orientação das larvas pré-seleccionado sem prejudicar os peixes, quer por choque térmico ou o endurecimento do gel. As larvas devem ser orientados diretamente sobre a tampa de vidro para reduzir a distância de trabalho para a Analy microscópico subsequentesis. Como isso pode ser um fator limitante durante microscopia a escolha dos objectivos adequados é obrigatória. Uma vez montada, a larva possa ser mantida de horas a dias.

A condicionalidade do sistema modelo aqui apresentado permite a transformação repetida por ativação 4-OHT do transgene. O sistema de expressão depende da presença de 4-OHT e, portanto, a expressão KalTA4 controlada de um gene de interesse é reversível (Figura 1D, b). Em contraste com o sistema Cre-ER ^T2 / Lox, o que facilita um evento de recombinação irreversível genómico ^28, KalTA4 ^ER-T2 / UAS pode ser activada e desactivada por adição ou remoção de 4-OHT e este potencial para indução repetida é uma vantagem de a técnica sobre o sistema ^T2 / Lox Cre-ER. No entanto, o requisito de níveis constantes de 4-OHT é uma limitação, desde que a experiência tem que ser prolongado de dias a semanas.