Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu
Summary
Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.
Abstract
Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.
Introduction
Lenf düğümleri, yabancı ve öz-antijenlere karşı adaptif immün yanıtları başlatılan ve koordine özelleşmiş bölmeleri bulunmaktadır. Burada sunulan prosedür lenf düğümü, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve çeşitli moleküllerinin yüzey ekspresyonunu korumak uygun bir lenf düğümü stromal hücrelerin erişmek için kullanılan otomatik mekanik pipetleme ile birlikte kısa bir enzimatik sindirim açıklanmaktadır.
Lenf nodu stromal hücre üç önemli fonksiyonları lenf nodu iskele oluşturacak ve yerine: ilk onlar vücut sıvıları antijenleri, patojenleri ve onların patojen ilişkili moleküler pattern (PAMP) yanı sıra, sitokinler ve tehlike ilişkili moleküler model örnek filtre (Damps) mevcut Vücutta. İkincisi, etkileşim ve adaptif immün yanıtları başlatmak için antijen sunan hücreler (APC) ve lenfositler çekmek ve talimat; ve üçüncüsü, lenfosit 1 homeostası farklılaşması için yapısal bir ortam sağlamak-3. Inflamasyon lenf düğümü, stromal hücreleri büyüme faktörleri, sitokinler ve kemokinlerin üretimi sırasında, dendritik hücreler (DCler) arasındaki etkileşimi düzenlemek ve böylece, T-ve B-hücrelerinin adapte şişme. Bağışıklık tepkilerinin düzenleme, farklı stromal hücre popülasyonları tarafından meydana getirilen kompleks yapısal mimarisine mümkündür.
Lenf nodülü hücreleri, stromal, CD45 negatif hücrelerdir ve fibroblastik ve endotel hücreleri 1 -6 'de CD31 ile gp38 ifadesi ya da ayırt edilebilir. CD31 + kan endotel hücreleri tanımlar (BEC) -, gp38 + CD31 + lenfatik endotel hücreleri (LIK), gp38 tanımlar: – Gp38 + CD31 (fibroblastik retikulum hücreleri de FRC olarak bilinen TRC) T bölgesi retiküler hücreleri tanımlar. Bundan başka, alt-popülasyonlarının tanımlanması diğer lenf nodu stromal hücrelerin varlığını ortaya çıkarmıştır. Gerçekten de, küçük bir perisit benzeri hücre popülasyonu içinde karakterize edilmiştirgp38 – CD31 – nüfus 7. Bu nedenle, izolasyon prosedürü adaptasyonu farklı lenf düğümü stromal hücrelerin fonksiyonel özelliklerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için avantajlıdır.
Lenf düğümü hücreleri, stromal sindirim geliştirilmesi önce lenf düğümü stromal hücrelerin doku çalışma bölümü ve mikroskopi kullanılarak yerinde gözlemlerle sınırlıydı protokolleri. Bununla birlikte, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar lenf düğümü stromal hücrelerin önemli özellikleri gösterdi. Lenf nodülü hücreleri, stromal yüksek endotelial lenf nodu subkapsüler sinüs lenf ve ilgili-düşük molekül kütlesi, protein nakil kanal sistemi olarak adlandırılan karmaşık bir 3 boyutlu bir yapı oluşturmak üzere podoplanin, kolajen ve hücre dışı matris (ECM), proteinleri ile ilişkili T hücreleri bölgesinde 8 Venüller. DCler, stroma hücreleri ile yakın temas halinde olan ve boru şeklindeki con içine uzanan gözlemlenebilirDuit yapısı sıvı örneklemek ve antijenleri 8 algılamak için. DCler ile lenf düğümü stromal hücreler (Kızılay ve LECS) etkileşimi, kemokinler CCL21 ve CCL19 9,10 serbest bırakılması ve sunum aracılık eder. CCL19 ve CCL21 lenf nodu T hücre bölgesine 4,11 göç etmek DH'leri ve T hücrelerini kolaylaştırılması CCR7 reseptörü tarafından tanınır. Benzer kemokinlerle kullanarak rağmen, DC'ler ve T hücreleri lenf düğümlerine 12 içine farklı göç yolları var. Daha sonra, lenf düğümü ve saf lenf düğümü stromal hücrelerin izolasyonu enzimatik sindirim kullanılarak, fonksiyonel çalışmalar çeşitli lenf nodu stromal hücrelerin rolü DC'ler ve T / B hücreleri 6,13 ile etkileşim yetenekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, IFN-γ üreten efektör T hücrelerinin ve lenf düğümü stromal hücreler arasındaki karışma, ikincil lenfoid organların 14-16 T hücre yanıtları ve çoğalmasını azaltmak için gösterilen metabolit nitrik oksit üretimini indükler. İkinci olarak, lenf Kgazel stromal hücreler, IL-10, 17 üretimi ile düzenleyici DC alt kümelerinden farklılaşmasını desteklemek için ve IL-7 6,18 üretilmesi yoluyla saf T hücre homeostazının modüle bildirilmiştir. Üçüncü olarak, lenf düğümü stromal hücrelerde TLR sentezleme stromal hücreler, doku yaralanması sırasında ortaya çıkan bir enfeksiyon ya da kendi kendini moleküllerden türetilmektedir sinyale duyarlı olduğunu göstermektedir. Gerçekten de, TLR3 poli ligandla lenf düğümü stromal hücrelerin tedavisi (I: C) ile sonuçlanan büyük histo-uyumluluk kompleksi sınıf I ve eş-ifade önleyici molekülün PD-L1 upregülasyonu mütevazı bir düzenlenişini uyarmaktadır değil, birlikte uyaran moleküllerin periferal dokuda dramatik değişiklikler ifadesini 19 antijenleri. Çeşitli gruplar, lenf düğümü, stromal hücreleri periferal doku antijenleri ifade eder ve kendinden reaktif T hücrelerinin 19,21-27 indüklenmesidir göstermiştir. Bu nedenle, lenf düğümü hücreleri ve diğer göçmen ve yeniden arasındaki etkileşimleri anlamaksident lenf düğümü hücreleri iltihap sırasında aktivasyonu ya da bağışıklık tepkilerinin bastırılması sağlamak için yeni bir hedef moleküller bulmak için yardımcı olacaktır. Bu nedenle, lenf düğümü yayınlanmış enzimatik ayırma uygulanması gereklidir.
Daha önce yayınlanmış protokoller düşük mekanik stres 6,19,20 ile kollajenaz tabanlı enzimatik sindirim farklı kombinasyonları kullanın. Bununla birlikte, sindirim enzimlerinin veya sindirim enzim farklı bir kombinasyonu ile uzun inkubasyon aktivasyon durumunu analiz etmek ve yeni lenf nodu stromal hücreleri tanımlamak için gereken çeşitli yüzey molekülleri düşürebilir. Stromal hücre analiz türüne bağlı olarak, bağlantı veya Protokol Protokol Fletcher daha uygun olabilir. Tarif edilen prosedürde, biraz daha kısa bir enzimatik sindirim uygun bir lenf düğümü stromal hücrelerin yüzey işaretleyici zararın en aza düşürülmesi için otomatik mekanik ayrıştırma ile bir araya getirilmektedir. Bu işlem, yüksek ölçüde tekrarlanabilir ayrılmasını sağlayan vedüşük değişkenlik ve% 95 daha fazla canlılığı ile lenf nodu stromal hücre popülasyonlarının ayrım. Taze olarak izole edilen lenf nodülü hücreleri, stromal, doğrudan in vitro fonksiyonel deneyleri gerçekleştirmek için, stromal hücreleri hatlarının yüzey markeri ekspresyonu, protein analizi ve transkripsiyon çalışmalar, hem de kurulması için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lenf nodu stromal hücrelerin çalışması nedeniyle son zamanlarda yayımlanmış iki sindirim protokolleri 6,13 gelişimine bir araştırma odağı haline geldi. Her iki protokol tek bir lenf düğümü stromal hücreler elde etmek için yeterli, ancak sindirim enzimlerinin kullanılması ve sindirim zaman içinde farklılık gösterir. Stromal hücreler ve onların yüzey belirteçleri enzimatik sindirim ve mekanik strese karşı hassas olduğu için, optimize edilmiş bir protokol gereklidir.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.
Materials
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating funktion | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petridishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell – Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
- Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
- Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
- Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
- MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
- Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
- Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
- Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
- Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
- Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618 (2011).
- Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138 (2011).
- Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
- Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
- Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
- Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Lee, J. -. W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
- Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
- Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
- Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
- Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
