Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen

Lymfeklieren zijn gespecialiseerde compartimenten waar adaptieve immuunrespons tegen buitenlandse en zelf-antigenen worden geïnitieerd en gecoördineerd. De hier gepresenteerde betreft hier een korte enzymatische digestie gecombineerd met geautomatiseerde mechanische pipetteren om lymfeklier enkele celsuspensie te verkrijgen en toegang tot levensvatbare lymfeknoop stromale cellen die de oppervlakte-expressie van verscheidene moleculen kunnen onderhouden.

Lymfeklier stromale cellen vormen het skelet van de lymfeklieren en aan drie belangrijke functies: ten eerste ze filteren lichaamsvloeistoffen antigenen, pathogenen en hun pathogeen geassocieerde moleculaire patroon (PAMPs), alsook cytokines en gevaar geassocieerde moleculaire patroonvoorbeeld (DAMPs) aanwezig in het lichaam. Ten tweede, ze trekken en instrueren antigen presenterende cellen (APC) en lymfocyten te werken en initiëren adaptieve immuunreacties; en derde zij structureel omgeving voor de homeostase en differentiatie van lymfocyten ¹-3. Tijdens ontsteking lymfeknoop stromale cellen groeifactoren, cytokines en chemokines, passen zwelling daardoor organiseren de interactie tussen dendritische cellen (DCs), T-en B-cellen. De orkestratie van immuunresponsen alleen mogelijk door de complexe structurele architectuur opgebouwd uit verschillende stromale cel populaties.

Lymfeklier stromale cellen zijn CD45 negatieve cellen en kan worden onderscheiden door de expressie van CD31 of GP38 in fibroblastische en endotheelcellen ^{1 -6.} Gp38 ⁺ CD31 ^– T zone definieert reticulaire cellen (TRC, ook bekend als FRC: fibroblast reticulaire cellen), gp38 ⁺ CD31 ⁺ definieert lymfatische endotheelcellen (LEC), gp38 ^– CD31 ⁺ definieert bloed endotheelcellen (BEC). Verdere karakterisering van de subpopulaties onthulde het bestaan ​​van andere lymfeknoop stromacellen. Er werd een kleine pericyte-achtige celpopulatie kenmerk in degp38 ^– CD31 ^– bevolking ^7. Derhalve aanpassing van de isolatie moet voordelig voor identificatie en karakterisatie van de functionele eigenschappen van verschillende lymfeknoop stromacellen.

Vóór de ontwikkeling van lymfeknoop stromacellen digestie protocollen de studie van lymfeknoop stromacellen beperkt tot in situ metingen waarbij weefselsectie en microscopie. Niettemin structurele en functionele studies toonden belangrijke kenmerken van lymfeknoop stromale cellen. Lymfeknoop stromale cellen geassocieerd met podoplanin, collageen en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten een complex 3 dimensionale structuur genoemd leidingsysteem, dat lymfe en bijbehorende laag molecuulgewicht eiwitten vervoert van de subcapsulaire sinus van de lymfeklieren van de hoge endotheliale vormen venulen in de T-cellen zone ^8. DCs zijn in nauw contact met stromacellen en kunnen worden waargenomen uitsteekt in de buisvormige conduit structuur om te proeven van vocht en detecteren antigenen ^8. De interactie van de lymfeklier stromale cellen (TRC's en LEC's) met DC's wordt gemedieerd door de introductie en presentatie van chemokines CCL21 en CCL19 ^9,10. CCL19 en CCL21 zijn erkend door de CCR7 receptor faciliteren DC en T-cellen om te migreren naar de lymfeklieren T-cel zone ^4,11. Ondanks het gebruik van gelijkaardige chemokines, DC's en T-cellen hebben verschillende migratieroutes naar de lymfeklieren ^12. Later, middels enzymatische digestie van de lymfeklieren en isoleren van pure lymfeknoop stromacellen, functionele studies naar de rol van de verschillende lymfeknoop stromale cellen en hun vermogen tot interactie met DCs en T / B-cellen ^6,13. Eerst de overspraak tussen IFN-γ producerende effector T-cellen en de lymfeknoop stromale cellen induceert de productie van de metaboliet stikstofoxide aangetoond dat T-cel responsen en proliferatie temperen in de secundaire lymfoïde organen ^14-16. Ten tweede, lymfe node stromale cellen gemeld de differentiatie van regelgevende DC subsets ondersteunen via de productie van IL-10 ^17, en naïeve T cel homeostase moduleren via productie van IL-7 ^6,18. Ten derde, TLR expressie in lymfeknopen stromale cellen suggereert dat stromale cellen gevoelig voor signaal afgeleid van een infectie of zelf-moleculen model bij weefselbeschadiging. Inderdaad, de behandeling van lymfeklier stromale cellen met de ligand van TLR3 poly (I: C) induceert een bescheiden opregulatie van major histocompatibility complex klasse I expressie en opregulatie van co-remmende eiwit, PD-L1, maar niet die van costimulatoire moleculen, waardoor dramatische veranderingen in perifere weefsels antigenen expressie ^19. Verschillende groepen hebben aangetoond lymfeklier stromale cellen brengen perifere weefsel antigenen en veroorzaken tolerantie van zelf-reactieve T-cellen ^19,21-27. Daarom begrijpen van de interactie tussen lymfeknoop stromale cellen en andere migrerende en resident lymfeknoopcellen zal helpen om nieuwe targetmoleculen om activering of onderdrukking van de immuunrespons mogelijk te maken tijdens de ontsteking te vinden. Daarom wordt de uitvoering van de gepubliceerde enzymatische scheiding van de lymfeklier nodig.

Eerder verschenen protocollen maken gebruik van verschillende combinaties van collagenase-gebaseerde enzymatische digestie met lage mechanische belasting ^6,19,20. Er kunnen lange incubaties met spijsverteringsenzymen of andere combinatie van enzym digestie verschillende oppervlaktemoleculen die nodig is om de activeringsstatus analyseren en nieuwe lymfeknoop stromale cellen te identificeren degraderen. Afhankelijk van het type van de stromale cel analyse, kan het protocol Link Protocol Fletcher of meer geschikt. In de beschreven procedure wordt een iets kortere enzymatische digestie gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om oppervlaktemerker afbraak van levensvatbare lymfeknoop stromacellen minimaliseren. Deze procedure maakt het mogelijk zeer reproduceerbare isolatie enonderscheid lymfeklier stromale cel populaties met lage variabiliteit en meer dan 95% levensvatbaarheid. De vers geïsoleerde lymfeknopen stromale cellen kunnen direct worden gebruikt voor oppervlakte marker expressie, eiwitanalyse, en transcriptionele studies, alsmede het instellen van stromale cellijnen functionele assays in vitro.