Summary

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

Published: August 19, 2014
doi:

Summary

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Abstract

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Introduction

I linfonodi sono compartimenti specializzati in cui vengono avviate e coordinate risposte immunitarie adattative contro stranieri e di auto-antigeni. La procedura qui presentata descrive una breve digestione enzimatica combinata con pipettaggio meccanico automatizzato per ottenere linfonodo sospensione singola cella e ottenere l'accesso a linfonodali cellule stromali vitali che mantengono l'espressione di superficie di diverse molecole.

Formare cellule stromali linfonodale l'impalcatura del linfonodo e compiere tre funzioni principali: primo filtrano fluidi corporei di assaggiare antigeni, gli agenti patogeni e il loro modello molecolare associata patogeni (PAMP), così come le citochine e pericolo del modello molecolare associato (smorza) presente nel corpo. In secondo luogo, si attraggono e istruiscono le cellule presentanti l'antigene (APC) e linfociti di interagire e di avviare le risposte immunitarie adattative; e terzo, offrono un ambiente strutturale per l'omeostasi e la differenziazione dei linfociti 1-3. Durante le cellule stromali infiammazione dei linfonodi producono fattori di crescita, citochine e chemochine, adattarsi al rigonfiamento in tal modo organizzare l'interazione tra cellule dendritiche (DC), T, e B- cellule. L'orchestrazione delle risposte immunitarie è possibile solo a causa della complessa architettura strutturale formato da diverse popolazioni di cellule stromali.

Cellule stromali linfonodi sono cellule CD45 negativi e si distinguono per l'espressione di CD31 o gp38 in cellule endoteliali e fibroblastiche 1 -6. Gp38 + CD31 definisce le cellule della zona T reticolari (TRC, noto anche come FRC: cellule reticolari fibroblastiche), gp38 + CD31 + definisce cellule linfatiche endoteliali (LEC), gp38 CD31 + definisce cellule endoteliali del sangue (BEC). Inoltre, la caratterizzazione delle sottopopolazioni ha rivelato l'esistenza di altre cellule stromali linfonodali. Infatti, una piccola popolazione di cellule periciti-simile è stato caratterizzato nellagp38 CD31 la popolazione 7. Pertanto, l'adattamento della procedura di isolamento è vantaggiosa per l'identificazione e la caratterizzazione delle proprietà funzionali di varie cellule stromali linfonodali.

Prima dello sviluppo del linfonodo cellule stromali digestione protocolli di studio delle cellule stromali linfonodali era limitato a osservazioni in situ utilizzando la sezione di tessuto e microscopia. Tuttavia, studi strutturali e funzionali hanno mostrato caratteristiche importanti delle cellule stromali linfonodali. Cellule stromali linfonodi sono associati con podoplanin, collagene e della matrice extracellulare (ECM) proteine ​​per formare un complesso di 3 struttura dimensionale chiamato sistema conduit, che trasporta le proteine ​​linfatiche e massa molecolare associato-basso dal seno subcapsulare di linfonodo all'alta endoteliale venule nella T cellule zona 8. Dendritiche sono in stretto contatto con le cellule dello stroma e può osservare sporge nel con tubolarestruttura duit di campione di fluido e rilevare gli antigeni 8. L'interazione delle cellule stromali linfonodali (TRC e LECs) con DC è mediata dal rilascio e la presentazione delle chemochine CCL21 e CCL19 9,10. CCL19 e CCL21 sono riconosciuti dal recettore CCR7 facilitare dendritiche e le cellule T di migrare al linfonodo zona di cellule T 4,11. Nonostante l'uso di chemochine simili, le cellule DCs e T hanno diverse rotte migratorie verso i linfonodi 12. Successivamente, utilizzando la digestione enzimatica del linfonodo e l'isolamento delle cellule stromali linfonodali puri, studi funzionali sono stati condotti sul ruolo delle diverse cellule dei linfonodi stromali e la loro capacità di interagire con le cellule dendritiche e le cellule T / B 6,13. In primo luogo, il crosstalk tra la produzione di cellule T effettrici IFN-γ e cellule stromali linfonodali induce la produzione del metabolita ossido nitrico dimostrato di smorzare le risposte delle cellule T e la proliferazione negli organi linfoidi secondari 14-16. In secondo luogo, linfa ncellule stromali ODE sono stati riportati per supportare la differenziazione delle sottopopolazioni DC regolamentazione attraverso la produzione di IL-10 17, e di modulare naif omeostasi delle cellule T attraverso la produzione di IL-7 6,18. In terzo luogo, espressione di TLR in cellule stromali linfonodali suggerisce che le cellule stromali sono suscettibili di segnale derivato da una infezione o di auto-molecole rilasciato durante lesioni dei tessuti. Infatti, il trattamento di cellule stromali linfonodali con il ligando di TLR3 poly (I: C) induce una modesta sovraregolazione di grande espressione di istocompatibilità di classe I e sovraregolazione di co-inibitorio molecola PD-L1, ma non di molecole costimolatorie, con conseguente drammatici cambiamenti nel tessuto periferico antigeni espressione 19. Diversi gruppi hanno mostrato cellule stromali linfonodali esprimono antigeni tissutali periferiche e inducono tolleranza delle cellule T autoreattive 19,21-27. Pertanto, la comprensione delle interazioni tra cellule stromali linfonodali e l'altro re migratorio ecellule linfonodali sidente aiuteranno a trovare nuove molecole bersaglio per consentire l'attivazione o la soppressione delle risposte immunitarie durante l'infiammazione. Pertanto, è necessaria l'attuazione della separazione enzimatica pubblicata del linfonodo.

Protocolli precedentemente pubblicati utilizzano diverse combinazioni di base di collagenasi-digestione enzimatica con una bassa sollecitazione meccanica 6,19,20. Tuttavia, lunghe incubazioni con enzimi di digestione o la diversa combinazione di digestione enzimatica potrebbero degradare diverse molecole di superficie necessaria per analizzare lo stato di attivazione e di individuare nuove cellule stromali linfonodali. A seconda del tipo di analisi delle cellule stromali, il protocollo Link o Fletcher protocollo potrebbe essere più adatto. Nella procedura descritta, una digestione enzimatica leggermente più corto è combinato con disaggregazione meccanica automatizzata per ridurre al minimo la superficie marcatore degradazione delle cellule stromali nodo linfa vitale. Questa procedura consente di isolamento altamente riproducibile edistinzione dei linfonodi popolazioni di cellule stromali con bassa variabilità e di oltre il 95% vitalità. Le cellule stromali linfonodi isolati a fresco possono essere utilizzati direttamente per l'espressione marcatore di superficie, analisi delle proteine, e gli studi trascrizionali, nonché creazione di linee di cellule stromali di effettuare saggi funzionali in vitro.

Protocol

In questa pubblicazione video e protocollo, sono state effettuate tutte le procedure sugli animali conformemente al protocollo animali approvato dalla Autorità cantonale di Basilea Città, Svizzera. 1 Linfonodi Preparazione e digestione Acqua preriscaldo in un becher da 37 ° C su un agitatore magnetico con piastra di riscaldamento. Preparare Base Medio come segue: terreno DMEM (senza piruvato) supplementato con FCS 2%, 1,2 mM CaCl 2 e Pen / Strep (100 unità…

Representative Results

Il presente protocollo è un protocollo di digestione modificata pubblicato da Link et al., 2007 6 con un tempo di digestione breve (45 minuti massimo) a causa di disaggregazione meccanica con una pipetta multicanale automatizzata. Inoltre, la procedura è più standardizzato, minimizza la degradazione dei marcatori di superficie su diverse cellule stromali linfonodali e permette la gestione di più di un campione allo stesso tempo. Collagenase IV e Collagenase D in Links…

Discussion

Lo studio delle cellule stromali linfonodali recentemente è diventato un focus di ricerca a causa dello sviluppo di due protocolli di digestione pubblicati 6,13. Entrambi i protocolli sono adeguate per ottenere cellule stromali nodo singolo linfatici ma differiscono per l'uso di enzimi digestivi e il tempo di digestione. Poiché le cellule stromali e loro marcatori di superficie sono sensibili alla digestione enzimatica e sollecitazioni meccaniche, è necessario un protocollo ottimizzato.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.

Materials

DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating funktion IKA-RCT-standard 9720250
Petridishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

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Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

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