عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية
Summary
Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.
Abstract
Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.
Introduction
الغدد الليمفاوية هي مقصورات المتخصصة حيث بدأت الاستجابات المناعية التكيفية ضد المستضدات الذاتية والخارجية ومنسقة. الإجراء المقدمة هنا يصف الهضم الأنزيمي قصيرة جنبا إلى جنب مع pipetting لالميكانيكي الآلي للحصول على العقدة اللمفاوية وحيدة الخلية تعليق والوصول إلى خلايا انسجة العقدة الليمفاوية قابلة للحياة التي تحافظ على التعبير السطح العديد من الجزيئات.
الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية تشكل سقالة من العقدة الليمفاوية والوفاء ثلاث وظائف رئيسية: أولا أنها تصفية سوائل الجسم لأخذ عينات المستضدات، ومسببات الأمراض والعوامل المسببة للأمراض المرتبطة نمط الجزيئية الخاصة بهم (PAMPs)، وكذلك السيتوكينات والخطر المرتبطة نمط الجزيئية (DAMPs) الحاضر في الجسم. ثانيا، جذب وإرشاد مستضد تقديم الخلايا (APC) والخلايا الليمفاوية للتفاعل والشروع في الاستجابات المناعية التكيفية. وثالثا، لأنها توفر بيئة الهيكلية للتوازن وتمايز الخلايا الليمفاوية 1-3. أثناء التهاب خلايا العقدة الليمفاوية انسجة تنتج عوامل النمو، السيتوكينات وكيموكينات، والتكيف مع تورم وبالتالي تنظيم التفاعل بين الخلايا الجذعية (DCS)، تي وخلايا ب. تزامن الاستجابات المناعية ممكن فقط بسبب بنية الهيكلية المعقدة التي شكلتها مختلف السكان الخلية اللحمية.
خلايا انسجة العقدة الليمفاوية هي خلايا CD45 السلبية ويمكن تمييزها عن طريق التعبير عن CD31 أو gp38 في خلايا ليفية والبطانية 1 -6. Gp38 + CD31 – يحدد خلايا T منطقة شبكي (TRC، والتي تعرف أيضا باسم FRC: خلايا الشبكية ليفية)، gp38 + CD31 + الخلايا الليمفاوية يعرف البطانية (كرا)، gp38 – CD31 + يحدد الخلايا البطانية في الدم (BEC). علاوة على ذلك، توصيف المجموعات السكانية الفرعية وكشف وجود خلايا انسجة العقدة الليمفاوية الأخرى. في الواقع، واتسم عدد صغير من السكان خلية تشبه خلية حوطية داخلgp38 – CD31 – السكان 7. لذا، والتكيف من إجراء العزل هو مفيد لتحديد وتوصيف خصائص وظيفية مختلفة من خلايا انسجة العقدة الليمفاوية.
قبل وضع العقدة الليمفاوية خلايا انسجة الهضم البروتوكولات دراسة خلايا انسجة العقدة الليمفاوية اقتصر على الرصدات في الموقع باستخدام قسم الأنسجة والفحص المجهري. ومع ذلك، أظهرت الدراسات البنيوية والوظيفية الخصائص المهمة للخلايا انسجة العقدة الليمفاوية. وترتبط خلايا انسجة العقدة الليمفاوية مع podoplanin، والكولاجين والمصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات لتشكيل بنية معقدة 3 الأبعاد يسمى نظام القناة الذي ينقل الليمفاوية وما يرتبط بها منخفضة الكتلة الجزيئية البروتينات من الجيوب تحت المحفظة من العقدة الليمفاوية إلى البطانية عالية الأوردة في منطقة خلايا T 8. البلدان النامية على اتصال وثيق مع خلايا سدى ويمكن ملاحظة جاحظ في يخدع أنبوبيهيكل duit لأخذ عينات السوائل وكشف المستضدات 8. وبوساطة تفاعل خلايا انسجة العقدة الليمفاوية (TRCS وموظفين المدنيين المحليين) مع البلدان النامية من خلال الإفراج وعرض كيموكينات CCL21 و CCL19 9،10. يتم الاعتراف CCL19 وCCL21 بواسطة مستقبلات CCR7 تسهيل البلدان النامية والخلايا T للهجرة إلى منطقة العقدة الليمفاوية الخلية T 4،11. على الرغم من استخدام كيموكينات مماثلة، وخلايا T البلدان النامية ولها طرق الهجرة المختلفة في الغدد الليمفاوية 12. في وقت لاحق، وذلك باستخدام الهضم الأنزيمي من العقدة الليمفاوية وعزل الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية نقية، وأجريت دراسات وظيفية على دور مختلف خلايا العقدة الليمفاوية اللحمية وقدرتها على التفاعل مع البلدان النامية وخلايا T / B 6،13. أولا، الحديث المتبادل بين IFN-γ إنتاج خلايا T المستجيب والخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية الحث على إنتاج أكسيد النيتريك المستقلب تبين أن يثبط استجابات الخلايا T والانتشار في أجهزة اللمفاوية الثانوية 14-16. ثانيا، الليمفاوية نوقد تم الإبلاغ عن خلايا انسجة صدى لدعم التفريق بين مجموعات فرعية DC التنظيمية عبر إنتاج IL-10 17، والسذاجة لتعديل توازن الخلايا التائية عبر إنتاج IL-7 6،18. ثالثا، TLR التعبير في خلايا انسجة العقدة الليمفاوية تشير إلى أن خلايا انسجة عرضة للإشارة مشتقة من عدوى أو الجزيئات الذاتية صدر خلال إصابة الأنسجة. والواقع أن علاج الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية مع يجند من TLR3 بولي (I: C) يؤدي الى upregulation متواضع من التوافق النسيجي الرئيسي التعبير الدرجة الأولى ومعقدة upregulation المشترك المثبطة جزيء PD-L1، ولكن ليس من الجزيئات costimulatory، مما أدى إلى تغييرات جذرية في الأنسجة الطرفية مستضدات التعبير 19. وقد أظهرت عدة مجموعات خلايا انسجة العقدة الليمفاوية التعبير عن مستضدات الأنسجة الطرفية وتحفز التسامح من ذاتية التفاعل خلايا T 19،21-27. لذا، فهم التفاعلات بين الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية وغيرها من إعادة المهاجرة وسوف المنشقة خلايا العقدة اللمفاوية يساعد على إيجاد الجزيئات المستهدفة الجديدة للسماح تفعيل أو قمع الاستجابات المناعية أثناء الالتهاب. ولذلك، هناك حاجة إلى تنفيذ الفصل الأنزيمية نشرت من العقدة الليمفاوية.
البروتوكولات نشرت سابقا استخدام تركيبات مختلفة من القائم كولاجيناز الأنزيمية الهضم مع انخفاض الضغط الميكانيكي 6،19،20. ومع ذلك، حضانات طويلة مع إنزيمات الهضم أو مزيج مختلف من انزيم الهضم قد تتحلل مختلف الجزيئات السطحية اللازمة لتحليل حالة التنشيط وتحديد خلايا انسجة العقدة الليمفاوية جديدة. اعتمادا على نوع من التحليل الخلايا اللحمية، وبروتوكول وصلة أو بروتوكول فليتشر قد يكون أكثر ملاءمة. في الإجراء وصفها، يتم الجمع بين الهضم الأنزيمي أقصر قليلا مع تصنيف الميكانيكي الآلي للحد من تدهور سطح علامة قابلة للحياة الخلايا الليمفاوية من عقدة اللحمية. يتيح هذا الإجراء العزلة استنساخه للغاية وتمييز من العقدة الليمفاوية السكان الخلية اللحمية مع تقلب منخفض وأكثر من 95٪ جدوى. الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية المعزولة حديثا يمكن استخدامها مباشرة للتعبير عن علامة السطح، وتحليل البروتين، والدراسات النسخي، وكذلك إنشاء خطوط خلايا انسجة لإجراء المقايسات الفنية في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
دراسة خلايا انسجة العقدة الليمفاوية أصبحت في الآونة الأخيرة التركيز على البحوث نظرا لتطوير بروتوكولين الهضم نشرت 6،13. كلا البروتوكولين كافية للحصول على الخلايا الليمفاوية واحد العقدة انسجة ولكنها تختلف في استخدام إنزيمات الهضم ووقت الهضم. منذ خلايا انسجة وعل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.
Materials
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating funktion | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petridishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell – Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
- Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
- Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
- Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
- MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
- Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
- Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
- Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
- Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
- Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618 (2011).
- Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138 (2011).
- Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
- Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
- Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
- Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Lee, J. -. W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
- Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
- Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
- Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
- Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
