Isolement de cellules murines ganglions lymphatiques stromales

Les ganglions lymphatiques sont des compartiments spécialisés où les réponses immunitaires adaptatives contre des antigènes étrangers autonomes et sont initiés et coordonnés. La procédure présentée ici décrit une digestion enzymatique courte combinée avec pipetage mécanique automatisé pour obtenir des ganglions lymphatiques suspension cellulaire unique et accéder aux cellules stromales ganglionnaires viables qui maintiennent l'expression de surface de plusieurs molécules.

former cellules stromales ganglionnaire l'échafaud du ganglion lymphatique et remplit trois grandes fonctions: ils filtrent première fluides corporels pour déguster des antigènes, des agents pathogènes et leur pathogène motif moléculaire associé (PAMP), ainsi que des cytokines et danger motif moléculaire associé (atténue) présente dans le corps. Deuxièmement, ils attirent et instruisent les cellules présentatrices d'antigènes (APC) et des lymphocytes d'interagir et d'initier des réponses immunitaires adaptatives; et la troisième, ils fournissent un environnement structurel pour l'homéostasie et la différenciation des lymphocytes ¹-3. Pendant les cellules ganglionnaires du stroma de l'inflammation produisent des facteurs de croissance, des cytokines et des chimiokines, à adapter l'organisation de gonflement ainsi l'interaction entre les cellules dendritiques (DCs), T et les cellules B. L'orchestration de réponses immunitaires est seulement possible en raison de l'architecture structurale complexe formé par les différentes populations de cellules stromales.

Les cellules stromales de ganglions lymphatiques sont des cellules CD45 négatives et peuvent être distinguées par l'expression de CD31 ou de gp38 dans les cellules endothéliales et fibroblastiques ^{1 -6.} Gp38 ⁺ CD31 ^– définit les cellules de la zone T réticulaire (TRC, également connu sous le FRC: les cellules réticulaires fibroblastiques), gp38 ⁺ CD31 ⁺ définit cellules lymphatiques endothéliales (LEC), gp38 ^– CD31 ⁺ définit les cellules endothéliales de sang (BEC). En outre, la caractérisation des sous-populations a révélé l'existence d'autres cellules stromales de ganglions lymphatiques. En effet, une petite population de cellules pericyte comme a été caractérisée dans legp38 ^– CD31 ^– population ^7. Par conséquent, l'adaptation de la procédure d'isolement est avantageux pour l'identification et la caractérisation des propriétés fonctionnelles différentes cellules stromales de ganglions lymphatiques.

Avant le développement des ganglions lymphatiques cellules stromales digestion protocoles de l'étude des cellules stromales de ganglion lymphatique a été limitée à des observations in situ en utilisant la section de tissu et la microscopie. Néanmoins, des études structurales et fonctionnelles ont montré des caractéristiques importantes des cellules stromales de ganglions lymphatiques. Les cellules stromales de ganglions lymphatiques sont associés à podoplanin, du collagène et de la matrice extracellulaire des protéines (ECM) pour former un complexe d'une structure en 3 dimensions appelé système de conduites qui transporte les protéines lymphatiques et de masse moléculaire associé-bas à partir du sinus sous-capsulaire du ganglion de la haute endothéliale veinules dans la zone des cellules T ^8. DCs sont en contact étroit avec les cellules du stroma et peut être observé dans la saillie tubulaire constructure duit à l'échantillon liquide et de détecter les antigènes ^8. L'interaction des cellules stromales de ganglions lymphatiques (TRC et ESL) avec les PED est médiée par la presse et la présentation des chimiokines CCL21 et CCL19 ^9,10. CCL19 et CCL21 sont reconnus par le récepteur CCR7 faciliter les DC et les cellules T à migrer vers la zone des cellules T des ganglions lymphatiques ^4,11. Malgré l'utilisation de chimiokines similaires, les cellules T ont PED et les routes de migration différentes dans les ganglions lymphatiques ^12. Par la suite, en utilisant une digestion enzymatique de ganglion lymphatique et de l'isolement des cellules stromales de ganglions lymphatiques pures, des études fonctionnelles ont été effectuées sur le rôle des différentes cellules des ganglions lymphatiques de stroma et de leur capacité à interagir avec des DC et des lymphocytes T / B ^6,13. Tout d'abord, la diaphonie entre les cellules T productrices d'IFN-effectrices de γ et de cellules stromales de ganglions lymphatiques induit la production d'oxyde nitrique du métabolite montré à atténuer les réponses des lymphocytes T et la prolifération dans des organes lymphoïdes secondaires ^{14 à 16.} Deuxièmement, la lymphe node cellules stromales ont été rapportés pour soutenir la différenciation de sous-ensembles de régulation à courant continu par l'intermédiaire de la production d'IL-10 ^17, et à moduler naïf homéostasie des cellules T par l'intermédiaire de la production d'IL-7 ^6,18. En troisième lieu, l'expression des TLR dans les cellules stromales de ganglions lymphatiques suggère que les cellules stromales sont sensibles à un signal dérivé de l'infection ou des auto-molécules libéré au cours de la lésion tissulaire. En effet, le traitement de cellules stromales de ganglions lymphatiques avec le ligand de TLR3 poly (I: C) induit une régulation à la hausse modeste de grande expression d'histocompatibilité de classe complexe I et la régulation positive de co-inhibiteur molécule PD-L1, mais pas de molécules de costimulation, ce qui des changements dramatiques dans les tissus périphériques antigènes expression ^19. Plusieurs groupes ont montré des cellules stromales de ganglions lymphatiques expriment des antigènes de tissus périphériques et induire une tolérance des cellules T autoréactives ^19,21-27. Par conséquent, la compréhension des interactions entre les cellules stromales de ganglions lymphatiques et l'autre re migratoire etcellules ganglionnaires sident aideront à trouver de nouvelles molécules cibles pour permettre l'activation ou la suppression de la réponse immunitaire lors de l'inflammation. Par conséquent, la mise en œuvre de la séparation enzymatique de la publication du ganglion lymphatique est nécessaire.

Protocoles publiés précédemment utilisent différentes combinaisons de base de la collagénase-digestion enzymatique avec une faible contrainte mécanique ^6,19,20. Cependant, de longues incubations avec des enzymes de digestion ou de la combinaison différente de digestion enzymatique peuvent dégrader diverses molécules de surface nécessaires pour analyser l'état d'activation et d'identifier de nouvelles cellules stromales ganglionnaires. Selon le type de l'analyse de cellules du stroma, le Protocole de liaison Protocole Fletcher ou peut-être plus approprié. Dans la procédure décrite, une digestion enzymatique légèrement plus courte est associée à la ventilation mécanique automatisé pour minimiser la dégradation de surface marqueur des cellules stromales nœud lymphatiques viable. Cette procédure permet d'isoler hautement reproductible etdistinction des populations de cellules stromales de ganglions lymphatiques avec une faible variabilité et plus de 95% de viabilité. Les cellules stromales de ganglions lymphatiques fraîchement isolées peuvent être directement utilisés pour l'expression de marqueurs de surface, l'analyse des protéines, et des études de la transcription, ainsi que la création de lignées de cellules stromales pour effectuer des tests fonctionnels in vitro.