בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה
Summary
Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.
Abstract
Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.
Introduction
בלוטות הלימפה הן תאים מיוחדים שבו תגובה חיסונית אדפטיבית נגד אנטיגנים עצמיים-זרים והם יזמו ותאמו. ההליך שהוצג כאן מתאר עיכול אנזימטי קצר בשילוב עם pipetting המכני האוטומטי לקבל השעיה תא בודד בלוטה לימפה ולקבל גישה לתאי סטרומה בלוטה לימפה קיימא השומרים על הבעת פני השטח של כמה מולקולות.
תא סטרומה בלוטה לימפה בצורת הפיגום של בלוטות לימפה ולמלא שלושה תפקידים מרכזיים: ראשון שהם לסנן נוזלי גוף לדגום אנטיגנים, פתוגנים והדפוס שלהם הפתוגן הקשורים המולקולרי (PAMPs), כמו גם ציטוקינים ודפוס מולקולרי הקשורים סכנה (damps) נוכחי בגוף. שנית, הם מושכים ולהורות תאי הצגת אנטיגן (APC) ולימפוציטים מסוג האינטראקציה וליזום תגובה חיסונית אדפטיבית; ושלישית, הם מספקים סביבה מבנית להומאוסטזיס וההתמיינות של לימפוציטים מסוג 1-3. במהלך תאי סטרומה הבלוטה לימפה לדלקת לייצר גורמי גדילה, ציטוקינים וכמוקינים, להסתגל לנפיחות ובכך ארגון האינטראקציה בין תאים דנדריטים (DCS), טריקו, וB- תאים. התזמור של תגובות חיסוניות אפשרי רק בשל הארכיטקטורה המבנית המורכבת שהוקמה על ידי אוכלוסיות תאי סטרומה שונות.
תאי סטרומה בלוטה לימפה הם תאים שליליים CD45 וניתן להבחין על ידי הביטוי של CD31 או gp38 בתאי fibroblastic ואנדותל 1 -6. Gp38 + CD31 – מגדיר תאי אזור T רשתי (TRC, הידוע גם בFRC: תאי רשתית fibroblastic), gp38 + CD31 + מגדיר תאי הלימפה אנדותל (LEC), gp38 – CD31 + מגדיר תאי האנדותל בדם (BEC). יתר על כן, אפיון של האוכלוסיות חשף את קיומם של תאי סטרומה בלוטה לימפה אחרים. ואכן, אוכלוסיית תאים כמו pericyte קטנה התאפיינה בתוךgp38 – CD31 – אוכלוסיית 7. לכן, עיבוד של הליך הבידוד הוא יתרון עבור זיהוי ואפיון של התכונות פונקציונליות של תאי סטרומה בלוטה לימפה שונים.
לפני הפיתוח של מערכת עיכול תאי סטרומה בלוטה לימפה פרוטוקולי המחקר של תאי סטרומה בלוטה לימפה היה מוגבל בתצפיות באתר באמצעות סעיף ומיקרוסקופיה רקמה. עם זאת, מחקרים מבניים ותפקודיים הראו מאפיינים חשובים של תאי סטרומה בלוטה לימפה. תאי סטרומה בלוטה לימפה קשורים עם podoplanin, קולגן ומטריצת חוץ תאית חלבונים (ECM) כדי ליצור מבנה מורכב 3 ממדים הנקרא מערכת צינור, שמעביר חלבונים לימפה ומסה מולקולרית הקשורים נמוכה מסינוס subcapsular של הבלוטה לימפה לגבוהה אנדותל venules באזור תאי T 8. DCs נמצא בקשר הדוק עם תאי סטרומה ואפשר לראות בולט לקון צינורימבנה duit לדגום נוזל ולזהות אנטיגנים 8. האינטראקציה של תאי בלוטה לימפה סטרומה (TRCs וLECs) עם DCs מתווכת על ידי השחרור וההצגה של CCL21 כמוקינים וCCL19 9,10. CCL19 וCCL21 מוכרים על ידי קולטן CCR7 להקל DCs ותאי T לנדוד לאזור תא T הבלוטה לימפה 4,11. למרות שימוש בכמוקינים דומים, יש לי תאי DCs וT מסלולי נדידה שונים לבלוטות הלימפה 12. מאוחר יותר, באמצעות עיכול אנזימטי של בלוטות לימפה ובידוד של תאי סטרומה בלוטה לימפה טהורים, מחקרים פונקציונליים בוצעו על עצם את התפקיד של תאי סטרומה הבלוטה לימפה השונים והיכולת שלהם לתקשר עם DCs וT / תאי B 6,13. ראשית, crosstalk בין תאי IFN-γ ייצור מפעיל T ותאי סטרומה בלוטה לימפה גורם ייצור של תחמוצת חנקן המטבוליט מוצגת לצנן תגובות תא T ושגשוג באיברי הלימפה המשניים 14-16. שנית, לימפה nתאי סטרומה שיר הלל כבר דיווחו לתמיכה בבידול של תת DC רגולציה באמצעות הייצור של IL-10 17, ולווסת הומאוסטזיס תא T נאיבי באמצעות הייצור של IL-7 6,18. שלישית, ביטוי TLR בתאי סטרומה בלוטה לימפה מצביע על כך שתאי סטרומה רגישים לאותות הנגזרים מזיהום או מולקולות עצמית שפורסם במהלך פגיעה ברקמות. ואכן, הטיפול בתאים סטרומה בלוטה לימפה עם ליגנד של פולי TLR3 (אני: C) גורם גברת ביטוי צנועה של גדול אני כיתה המורכבת histocompatibility ביטוי וגברת ביטוי של מולקולת שיתוף מעכב PD-L1, אך לא של מולקולות costimulatory, וכתוצאה מכך שינויים דרמטיים ברקמות היקפי אנטיגנים ביטוי 19. כמה קבוצות הראו תאי סטרומה בלוטה לימפה לבטא אנטיגנים רקמות היקפיים ולגרום לסובלנות של תאי T עצמי תגובתי 19,21-27. לכן, הבנת יחסי הגומלין בין תאי סטרומה בלוטה לימפה ומחדש נודדים והאחרותתאי בלוטה לימפה sident יעזרו למצוא מולקולות יעד חדשות כדי לאפשר הפעלה או דיכוי של מערכת חיסונית בזמן דלקת. לכן, יש צורך ביישום ההפרדה האנזימטית שפורסמה של בלוטות לימפה.
פרוטוקולים שפורסמו בעבר להשתמש בשילובים שונים של עיכול אנזימטי מבוסס collagenase עם לחץ מכאני נמוך 6,19,20. עם זאת, incubations הארוך עם אנזימי עיכול או שילוב של אנזים עיכול שונה עלול לבזות מולקולות פני השטח שונות הנדרשות על מנת לנתח את מצב ההפעלה ולזהות תאי סטרומה בלוטה לימפה חדשים. בהתאם לסוג של ניתוח תא סטרומה, פרוטוקול הקישור או פלטשר הפרוטוקול עשוי להיות מתאים יותר. בהליך המתואר, עיכול אנזימטי מעט קצר יותר בשילוב עם פיצול של מכאני אוטומטי כדי למזער השפלה סמן פני השטח של תאי סטרומה הבלוטה לימפה קיימא. הליך זה מאפשר בידוד מאוד לשחזור והבחנה של אוכלוסיות תאי סטרומה בלוטה לימפה עם שונות נמוכות וכדאיות יותר מ 95%. תאי סטרומה הבלוטה לימפה המבודדים הטרי ניתן להשתמש ישירות לביטוי סמן משטח, ניתוח חלבון, ומחקרי תעתיק, כמו גם הקמתה של קווי תאי סטרומה לבצע מבחני תפקודיים במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר של תאי סטרומה בלוטה לימפה לאחרונה הפך למוקד מחקר עקב התפתחותם של שני פרוטוקולי עיכול פורסם 6,13. שני הפרוטוקולים מספיקים כדי לקבל תאי סטרומה הבלוטה לימפה בודדת אך שונים בשימוש באנזימי עיכול ואת הזמן של עיכול. מאחר ותאי סטרומה וסמני פני השטח שלהם רגישים לעי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.
Materials
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating funktion | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petridishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell – Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
- Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
- Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
- Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
- MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
- Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
- Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
- Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
- Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
- Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618 (2011).
- Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138 (2011).
- Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
- Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
- Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
- Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Lee, J. -. W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
- Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
- Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
- Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
- Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
