Summary

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Published: August 19, 2014
doi:

Summary

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Abstract

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Introduction

Lymphknoten sind spezialisierte Fächer, wo adaptiven Immunantwort gegen fremde und Selbst-Antigene initiiert und koordiniert. Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt eine kurze enzymatische Verdauung kombiniert mit automatisierten mechanischen Pipettieren Lymphknoten Einzelzellsuspension zu erhalten und Zugang zu lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen, die die Oberflächenexpression von mehreren Molekülen zu erhalten.

Lymphknoten Stromazellen bilden das Gerüst des Lymphknotens und erfüllen drei wichtige Funktionen: sie filtern ersten Körperflüssigkeiten, Antigene, Krankheitserreger und ihre Erregermuster (PAMPs) sowie Zytokine und Gefahr assoziierte molekulare Muster zu probieren (gedämpft) vorhanden im Körper. Zweitens, sie ziehen und weisen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und Lymphozyten zu interagieren und zu initiieren adaptive Immunantworten; und die dritte, bieten sie eine strukturelle Umgebung für die Homöostase und Differenzierung von Lymphozyten 1-3. Während der Entzündung Lymphknoten Stromazellen produzieren Wachstumsfaktoren, Zytokine und Chemokine, die Anpassung an Schwellungen damit die Organisation der Interaktion zwischen dendritischen Zellen (DCs), T-und B-Zellen. Die Instrumentation von Immunantworten ist aufgrund der komplexen Strukturarchitektur von unterschiedlichen stromalen Zellpopulationen gebildet möglich.

Lymphknoten Stromazellen CD45-negativen Zellen und kann durch die Expression von CD31 und gp38 in Fibroblasten und Endothelzellen 1 -6 unterscheiden. Gp38 + CD31 T-Zone definiert Retikulumzellen (TRC, die auch als FRC bekannt: fibroblastischen Retikulumzellen), gp38 + CD31 + definiert lymphatischen Endothelzellen (LEC), gp38 CD31 + definiert Blut Endothelzellen (BEC). Weitere Charakterisierung von Subpopulationen zeigte die Existenz von anderen Lymphknoten Stromazellen. In der Tat wurde eine kleine pericyte artigen Zellpopulation innerhalb der gekennzeichnetgp38 CD31 Population 7. Daher ist die Anpassung des Isolationsverfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften von verschiedenen Lymphknoten Stromazellen vorteilhaft.

Vor der Entwicklung von Lymphknoten Stromazellen Verdauung Protokolle die Untersuchung von Lymphknoten Stromazellen wurde in situ Beobachtungen mit Gewebeabschnitt und Mikroskopie beschränkt. Dennoch zeigte strukturelle und funktionelle Untersuchungen wichtige Eigenschaften von Lymphknoten Stromazellen. Lymphknoten Stromazellen mit podoplanin, Kollagen und extrazellulärer Matrix (ECM) Proteinen verbunden, um eine komplexe dreidimensionale Struktur 3 genannte Leitungssystem, die Lymphe und assoziierten-niedermolekulare Proteine ​​auf die hohe endotheliale Transporte vom subkapsuläre Sinus des Lymphknotens bilden Venolen in der T-Zellen-Zone 8. DCs sind in engem Kontakt mit Stroma-Zellen und in das rohrförmige con vorstehenden beachtenDuit Struktur zu Probenflüssigkeit und erkennen Antigene 8. Die Wechselwirkung von Lymphknoten Stromazellen (TRCs und LECs) mit DCs ist durch die Freisetzung und Präsentation von Chemokinen CCL21 und CCL19 9,10 vermittelt. CCL19 und CCL21 werden von der CCR7 Rezeptor erleichtert DCs und T-Zellen zu den Lymphknoten T-Zell-Zone 4,11 migrieren anerkannt. Trotz Verwendung ähnlicher Chemokine DCs und T-Zellen haben unterschiedliche Wanderungs in die Lymphknoten 12. Später mittels enzymatischer Verdauung der Lymphknoten und Isolierung von reinem Lymphknoten Stromazellen, funktionelle Studien über die Rolle der verschiedenen Lymphknoten Stromazellen und ihre Fähigkeit, mit DCs und T / B-Zellen interagieren 6,13 durchgeführt. Zuerst wird das Übersprechen zwischen IFN-γ produzierenden T-Effektorzellen und Lymphknoten Stromazellen induziert die Produktion der gezeigten T-Zell-Antworten und die Proliferation in den sekundären lymphoiden Organen 14-16 dämpfen Metaboliten Stickoxid. Zweiten, Lymphe node Stromazellen wurde berichtet, dass die Differenzierung der DC regulatorischen Untergruppen über die Produktion von IL-10-17 zu unterstützen und naiven T-Zell-Homöostase durch die Produktion von IL-7 6,18 modulieren. Drittens TLR-Expression in Lymphknoten stromalen Zellen legt nahe, dass Stromazellen sind anfällig für eine Infektion oder selbst Moleküle während Gewebeverletzung freigesetzt abgeleiteten Signals. Tatsächlich ist die Behandlung von Lymphknoten Stromazellen mit dem Liganden von TLR3 Poly (I: C) induziert eine geringe Hochregulation von Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I-Expression und die Hochregulation von Co-inhibitorische Molekül PD-L1, jedoch nicht von kostimulatorischen Molekülen, was zu dramatische Veränderungen im peripheren Gewebe-Antigene Ausdruck 19. Mehrere Gruppen haben gezeigt, Lymphknoten Stromazellen exprimieren peripheren Gewebe-Antigene und induzieren Toleranz von selbstreaktiven T-Zellen 19,21-27. Daher, das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Lymphknoten Stromazellen und die andere Zugvögel und Wiedersident Lymphknotenzellen werden dabei helfen, neue Zielmoleküle zur Aktivierung oder Unterdrückung von Immunreaktionen während der Entzündung ermöglichen zu finden. Daher wird die Umsetzung der veröffentlichten enzymatische Trennung des Lymphknotens erforderlich.

Zuvor veröffentlichten Protokolle verwenden verschiedene Kombinationen von Kollagenase-basierte enzymatische Verdauung mit geringer mechanischer Belastung 6,19,20. Allerdings könnte lange Inkubationen mit Verdauungsenzymen oder andere Kombination von verschiedenen Enzym die Verdauung benötigt, um den Aktivierungsstatus zu analysieren und neue Lymphknoten Stromazellen identifizieren Oberflächenmoleküle abzubauen. Abhängig von der Art der stromalen Zellanalyse, kann die Link-Protocol-Protokoll oder Fletcher besser geeignet sein. Bei dem beschriebenen Verfahren wird eine etwas kürzere enzymatischen Verdau mit automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um Oberflächenmarker Abbau von lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen minimieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht hoch reproduzierbare Isolation undUnterscheidung von Lymphknoten Stroma-Zellpopulationen mit geringer Variabilität und mehr als 95% Lebensfähigkeit. Die frisch isolierten Lymphknoten Stromazellen können direkt für Oberflächenmarker-Expression, Proteinanalyse und Transkriptionsstudien sowie Errichtung Stromazellen Leitungen verwendet, um funktionelle Assays in vitro durchzuführen.

Protocol

In diesem Video-Veröffentlichung und Protokoll wurden alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit der von der kantonalen Behörde Basel-Stadt, Schweiz zugelassen Tier-Protokoll durchgeführt. 1. Lymphknoten Vorbereitung und Verdauung Pre-Wärme-Wasser in einem Becher auf 37 ° C auf einem Magnetrührer mit Heizplatte. Bereiten Basis Medium wie folgt: DMEM-Medium (ohne Pyruvat) mit 2% FCS, 1,2 mM CaCl 2 und Pen / Strep (100 Einheiten Penicillin, 100 ug Streptom…

Representative Results

Das vorliegende Protokoll ist ein von Link-et al., 2007 6 mit einer kürzeren Kochzeit (45 min maximal) durch mechanische Disaggregation mit einem automatisierten Mehrkanalpipette veröffentlicht modifizierten Verdauung Protokoll. Darüber hinaus ist das Verfahren eher standardisierte minimiert Abbau von Oberflächenmarkern auf verschiedenen Lymphknoten Stromazellen und ermöglicht die Behandlung von mehr als einer Probe gleichzeitig. Kollagenase IV und Collagenase D Link…

Discussion

Die Studie von Lymphknoten Stromazellen vor kurzem wurde ein Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung von zwei Protokolle veröffentlicht Verdauung 6,13. Beide Protokolle angemessen sind, um einzelne Lymphknoten Stromazellen zu erhalten, unterscheiden sich jedoch in der Verwendung von Verdauungsenzymen und dem Zeitpunkt der Verdauung. Da Stromazellen und ihre Oberflächenmarker empfindlich enzymatischen Verdau und mechanischer Belastung sind, wird ein optimiertes Protokoll erforderlich.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.

Materials

DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating funktion IKA-RCT-standard 9720250
Petridishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

References

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell – Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618 (2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138 (2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -. W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).

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Cite This Article
Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

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