Создание и Оптимизация Верховного установки пропускной изучать<em> Эпидермальный стафилококк</em> И<em> Mycobacterium Marinum</em> Инфекция в качестве модели для Drug Discovery
Summary
Это видео статье описывается высокую пропускную трубопровода, которая была успешно создана, чтобы заразить и анализировать большое количество эмбрионов рыбок данио, обеспечивающих новый мощный инструмент для соединения тестирования и лекарственных препаратов с использованием целый животных позвоночных организм.
Abstract
Данио рерио становятся ценным инструментом в доклинической фазе показы новых лекарственных препаратов в целом животной модели с высокой пропускной возможности скрининга. Они могут быть использованы для преодоления разрыва между сотовыми основе анализов на ранних стадиях и в естественных условиях проверки в моделях млекопитающих, уменьшая, таким образом, число соединений, проходящих через к тестированию на гораздо более дорогих моделях грызунов. В этом свете, в настоящем рукописи описывается новый высокую пропускную трубопровода с использованием данио, как в естественных условиях модельной системы для изучения эпидермального стафилококка и микобактерий Marinum инфекции. Эта установка позволяет поколение и анализ большого количества синхронных эмбрионов равномерно инфицированы. Кроме того, гибкость трубопровода позволяет пользователю легко реализовать другие платформы для улучшения разрешающей способности анализа при необходимости. Сочетание данио вместе с инновационной высокой пропускной TEchnologies открывает поле проверки на наркотики и открытия новых возможностей не только из-за прочности с помощью целого животную модель, но также из-за большого количества трансгенных линий, доступных которые могут быть использованы, чтобы расшифровать механизм действия новых соединений.
Introduction
На сегодняшний день данио (Danio рерио) было успешно установлено в качестве эффективной модели для изучения различных инфекционных заболеваний 1. Данио эмбриона предлагает уникальный возможностей в естественных изображений из-за их прозрачности и большого количества существующих трансгенных репортерных линий, экспрессирующих флуоресцентные белки. Это мощное сочетание позволяет отслеживать различные типы иммунных клеток во времени при взаимодействии с патогенов, таких как микобактерии Marinum, ближайшего родственника М. туберкулез 2 или эпидермальный стафилококк, главный причинным биоматериала, связанной инфекции 3-5. Различные маршруты инфекции могут быть использованы в эмбрионов данио рерио в зависимости от целей исследования 6.
Один из этих инфекционных маршрутов желток инъекции бактерий. Главное преимущество этого метода по сравнению с другими является то, что желток Infectiна может выполняться автоматически с помощью роботизированной инъекции, значительно уменьшая время впрыска и позволяет высокую воспроизводимость инфекции 7, 8.
Предыдущая работа, с использованием данио как высокой пропускной в естественных условиях модельной системы для изучения S. эпидермальный и М. Marinum инфекции показали, чтобы быть успешным 7, 8. Эта система способна для выявления прогрессирования заболевания через робота инъекции желтка из ранних эмбрионов и с помощью флуоресцентной считывания в качестве меры для бактериальной нагрузки. В соответствии с этим понятием, эта установка была оптимизирована и создана высокоэффективная высокую пропускную трубопровода с потенциалом генерировать большое количество равномерно инфицированных эмбрионов и отслеживать прогрессирование инфекции во время после лечения ряда соединений. Установленном установки можно генерировать до 8000 синхронных эмбрионов на экрандля прогрессирования заболевания, обработка таким образом до 2500 эмбрионов в час. Эмбрионы сортируются в зависимости от их бактериальной нагрузки с помощью автоматизированной системы, обеспечивая однородных групп инфицированных личинок. Кроме того, для проверки настройки, эффекты ссылкой известные предотвратить прогрессирование туберкулеза у млекопитающих были протестированы на эмбрионах, инфицированных M. штамм Marinum E11 или более опасной М штамм 9.
Это исследование подробно описывает высокую пропускную трубопровод, который был создан, чтобы быть в состоянии генерировать большое количество инфицированных эмбрионов и последующий анализ бактериальной прогрессии во время развития и после обработки соединением.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методология высокая пропускная описано в этой статье обеспечивает быстрый и экономически эффективный конвейер на экран большое количество эмбрионов и личинок рыб с различными типами инфекций. Используя большой племенной судно вместо традиционных одно-или семейными танков размножения способствует контроль над процессом нереста и поколение большего числа синхронных яиц. С улучшенной версии автоматизированной системы микро-инъекции 7, можно вводить до 2500 яиц почти все в той же стадии клеточного течение 1 часа. С помощью этих обновлений и улучшенного ПО целесообразно придать больше яиц, чем ранее было возможно, которые могут использоваться для выполнения больших экранов наркотиков с бактериальной пролиферации как зачитал. Однако этот метод по-прежнему ограничивается желток инъекцию, другие маршруты для инъекций, например, описанные Бенара и др.. (2012) 6, мы надеемся, будут включены в автоматизированную систему микро-инъекции в ближайшем будущем.
<р = класса "jove_content"> Хотя эти методы протестированные для скрининга данио, было бы полезно для приложений с других видов рыб, а также. Например, карп было указано иметь преимущества для экранов наркотиков. Как рыбок данио, яйца и эмбрионов ранних стадий, от карпа прозрачны, но с основным преимуществом своих больших размеров икры сотен тысяч яиц и наличия инбредных линий, которые предлагают более постоянный генетический фон 16.Анализ большого количества зараженных эмбрионов осуществляется с высокой пропускной большого потока частиц цитометра. Это устройство может сортировать проанализированы эмбрионов в нескольких пластин хорошо или чашке Петри делает его особенно подходящим для тестирования большого количества соединений. Если более высокое разрешение изображения необходимо, чем установка приспособлена таким образом, что большой поток частиц цитометра технологии могут быть использованы для предварительного скрининга и последующего анализа проб в среде черезположить с более высоким разрешением. Это может быть сделано с помощью технических средств досмотра позвоночных Automated 17, 18. Это устройство может автоматически собирать живые или фиксированные эмбрионов между 2 и 7 дней после оплодотворения из мульти пластины скважины или контейнер для массовых грузов, изображение 360 ° через капилляр с помощью КЛСМ или стерео микроскопии и распоряжаться снова через 2 контейнеров для массовых грузов, позволяющих ручной сортировки эмбрионов на основе от микроскопических изображений. Дальнейшее совершенствование позволит сортировку эмбриона после съемки в нескольких пластины а, следовательно, делает возможным экран автоматически большое количество отдельных эмбрионов в течение долгого времени с CLSM. Если предположить, что в будущих приложениях система скрининга Technology позвоночных Automated также может быть подключен к большому потока частиц цитометра технологии без необходимости предварительного личинок выдачи в нескольких луночные планшеты, приведет к более продвинутой сортировки.
Эта статья описывает установлениег оптимизация высокой настройки пропускной изучения S. эпидермальный и М. Marinum инфекции в качестве модели для открытия новых лекарств. Это показывает, что исход этих бактерий, вводимых в желтке зависит от стадии развития яиц во время инъекции. Потребители инъекционных М. Marinum E11 на 16-128 клеточной стадии или штамма M на 16-64 клеточной стадии приводит к тому же инфекции схеме, хвостового инъекции вены 2, 6. Однако эта установка не ограничивается распространением только бактериальных патогенов. Было показано, до этого можно с помощью робота вводить растворы, содержащие ДНК, РНК или Morpholinos для трансгенеза, более-выражения и генной нокдауна исследования, соответственно 13. Кроме того, было показано, что эта установка также полезен для изучения пролиферации раковых клеток и миграции. Поэтому этот трубопровод представляет собой универсальный способ высокой пропускной экраны различных сигнальных механизмов в контекстеврожденного иммунитета, применительно к инфекционных заболеваний и развитии рака. Эти экраны могут быть объединены с другими для открытия медицины, но и с анализом возможных токсических эффектов, определенных применимых препаратов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Leonie де Бур и Bas Zaat (Академический медицинский центр) за предоставление нам с S. эпидермальный О-47 штамм. Мы благодарим Рико Bongaarts, Фрэнсис Смет и Ангела Comas (Союз Biometrica) за помощью и советом с Copas XL и VAST анализа BioImager. Мы благодарим Дави де Витт, Ульрике Nehrdich и Лаура ван Hulst для рыб заведование и других коллег из Лейденского университета за полезные обсуждения. Это исследование является частью проекта P5.03 IBIZA исследовательской программы в биомедицинских материалов института, совместно финансируемого голландским Министерством экономики и Программы Смарт Mix (NWOA_6QY9BM) Нидерландов Министерства экономики и Нидерланды Министерство образования, культуры и науки. Дополнительная поддержка была получена от проекта ЕС ZF-Здоровье (FP7-Здоровье-2009-242048), и RMJ поддержали Марии Кюри общении как опытного исследователя в начальной подготовки сети FishForPharma (PITN-GA-201 ЕС1-289209). SJR получил финансирование от инновационных лекарственных средств Инициатива совместного проекта по договору грант п ° 115 337, ресурсы которого состоят из финансового участия со стороны Рамочной программы Европейского Союза Седьмой (FP7/2007-2013) и EFPIA компаний в добрые авторов contribution.The дальнейшего подтверждения финансовая поддержка со стороны университета фонда Лейденского (LUF) для робототехники и от Cyttron, в субсидиях программы Besluit Investeringen Kennisinfrastructuur, который в свою очередь при финансовой поддержке Нидерландской организации научных исследований для визуализации объектов. Приобретение системы Copas была частично поддержана Отдела по Земле и наук о жизни (ALW) при финансовой помощи от Нидерландской организации научных исследований (NWO, 834.10.004).
Materials
| Middlebrook 7H10 agar | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 271310 | |
| BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211886 | |
| BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211887 | |
| LB agar | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L5542 | Multiple suppliers |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L3022 | Multiple suppliers |
| Chloramphenicol | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 16785.03 | Multiple suppliers |
| Hygromycin | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 25966.01 | Multiple suppliers |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | P1754 | Multiple suppliers |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Calbiochem, San Diego, California, USA | 529504 | Multiple suppliers |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | A5040 | |
| Agarose | Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands | S103 | Multiple suppliers |
| Instant ocean sea salt | Sera Marin, Heinsberg, Germany | 5460 | |
| iSPAWN | Techniplast, Buguggiate, Italy | iSPAWN | |
| Automated microinjection system | Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands | Automated microinjection system | |
| Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | COPAS XL | |
| Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | VAST BioImager | |
| LP Sampler | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | LP Sampler | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SL | |
| Injection needle 10 µm inner diameter | Qvotek, Mississauga, Canada |
References
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. , (2012).
- Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
- Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
- Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
- Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
- Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
- Chang, T. -. Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).
