הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em> סטפילוקוקוס epidermidis</em> ו<em> Marinum Mycobacterium</em> זיהום כמודל לגילוי תרופות
Summary
מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה.
Abstract
דג הזברה הופך כלי רב ערך בשלב קליני של הקרנות גילוי סמים כמודל חיה שלמה עם אפשרויות הקרנת תפוקה גבוהה. הם יכולים לשמש כדי לגשר על הפער בין מבחני תא מבוסס בשלבים מוקדמים יותר ובאימות vivo במודלים של יונקים, צמצום, בדרך זו, מספר התרכובות שעברו לבדיקות במודלים של מכרסמים הרבה יותר יקר. לאור זאת, בכתב היד הנוכחי מתואר צינור תפוקה גבוהה חדש באמצעות דג הזברה כמערכת מודל בvivo לחקר Staphylococcus epidermidis וזיהום marinum Mycobacterium. הגדרה זו מאפשרת לדור והניתוח של מספר הגדול של עוברי סינכרוני נגוע homogenously. יתר על כן הגמישות של הצינור מאפשרת למשתמש ליישם פלטפורמות אחרות כדי לשפר את הרזולוציה של הניתוח בעת הצורך בקלות. שילוב של דג הזברה יחד עם te תפוקה גבוה החדשניchnologies פותח את תחום בדיקות סמים וגילוי לאפשרויות חדשות לא רק בגלל כוחו של שימוש במודל של בעלי חיים כולו, אלא גם בגלל המספר הגדול של קווים זמינים מהונדסים שניתן להשתמש בם כדי לפענח את אופן פעולה של תרכובות חדשות.
Introduction
עד כה דג הזברה (Danio rerio) כבר נקבע בהצלחה כמודל יעיל ללמוד מגוון רחב של מחלות זיהומיות 1. עובר דג הזברה מציע ייחודי באפשרויות ההדמיה vivo בשל השקיפות והמספר הגדול של קווי כתב מהונדסים קיימים לבטא חלבוני ניאון שלהם. שילוב רב עוצמה זה מאפשר לעקוב אחר סוגי תאים חיסוניים שונים בזמן תוך אינטראקציה עם גורמי מחלה כגון Mycobacterium marinum, יחסית הקרובים ביותר של מ ' שחפת 2, או סטפילוקוקוס epidermidis, סיבתי העיקרית לזיהום קשור ביולוגי 3-5. מסלולים שונים של זיהום ניתן להשתמש בעוברי דג הזברה בהתאם למטרות של המחקר 6.
אחד ממסלולי זיהום אלה הוא הזרקת חלמון של החיידקים. היתרון העיקרי של שיטה זו בהשוואה לאחרים הוא שinfecti החלמוןיכול להתבצע באופן אוטומטי באמצעות הזרקה רובוטית, צמצום משמעותי של זמן ההזרקה ומאפשר שחזור גבוה של הזיהום 7, 8.
עבודה קודמת, תוך שימוש בדג הזברה כתפוקה גבוהה במערכת מודל vivo ללימוד ס epidermidis ומ ' זיהום marinum הראה כדי להצליח 7, 8. מערכת זו היא מסוגלת להקרין להתקדמות מחלה באמצעות הזרקה רובוטית חלמון של עוברים מוקדמים ושימוש בקריאת נתוני הקרינה כאמצעי לעומס החיידקים. בהסכם עם הרעיון הזה, התקנה זה כבר מותאם והקימה צינור תפוקה גבוהה יעיל ביותר עם הפוטנציאל ליצירת מספר גדול של עוברים נגועים homogenously ולעקוב אחר ההתקדמות של הזיהום במהלך הזמן לאחר טיפול עם מספר רב של תרכובות. עם ההתקנה הוקמה זה אפשרי לייצר עד 8,000 עוברי סינכרוני למסךלהתקדמות מחלה, עיבוד בדרך עד 2,500 עוברים לשעה זו. עוברים מסודרים מבוססים על עומס החיידקים שלהם באמצעות מערכת אוטומטית, מה שמבטיח קבוצות הומוגניות של זחלים נגועים. יתר על כן, כדי לאמת את ההתקנה, השפעות של התייחסות הידועה כדי למנוע את התקדמות מחלת השחפת ביונקים נבדקו על עוברים נגועים במ ' זן marinum E11 או זן M הארסי יותר 9.
מחקר זה מתאר בפירוט את צינור התפוקה הגבוה שהוקם כדי להיות מסוגל לייצר מספר גדול של עוברים נגועים וניתוח בדיעבד של התקדמות החיידקים במהלך פיתוח ולאחר טיפול מתחם.
Protocol
Representative Results
Discussion
המתודולוגיה התפוקה הגבוהה שתוארה במאמר זה מספקת צינור יעיל מהיר ועלות למסך מספר גבוה של עוברי דגים וזחלים עם סוגים שונים של זיהומים. שימוש בכלי הגידול הגדול במקום טנקי גידול בודדים או משפחה מסורתיים הקל על שליטה בתהליך ההשרצה ודור של מספר גדול יותר של ביצי סינכרוני. עם גרסה משופרת של מערכת מיקרו ההזרקה האוטומטית 7, ניתן להזריק עד 2,500 ביצים כמעט כולם באותו שלב התאים בתוך שעה 1. עם עדכונים אלה ותוכנה משופרת זה אפשרי להזריק יותר ביצים מאשר היה אפשרי בעבר שבו ניתן להשתמש כדי לבצע מסכי סמים גדולים עם התפשטות חיידקים כהקריאו. אולם שיטה זו עדיין מוגבלת לחלמון הזרקה, מסלולי הזרקה אחרים לדוגמא שתוארו על ידי ברנארד ואח'. (2012) 6, יהיו בתקווה להיות משולבים במערכת מיקרו ההזרקה האוטומטית בעתיד הקרוב.
<כיתת p = "jove_content"> למרות שהשיטות אלה השוותה להקרנת דג הזברה, שזה יהיה שימושי עבור יישומים עם מיני דגים אחרים גם כן. לדוגמא, קרפיון הנפוץ כבר ציין שיש יתרונות למסכים בסמים. כמו דג הזברה, ביצים ועוברים בשלב מוקדם מקרפיון הנפוץ הם שקופות, אבל עם היתרון העיקרי של גודל שרצים הגדול של מאה אלפי ביצים ואת הזמינות של קווים טהורים המציעים רקע גנטי קבוע יותר 16.הניתוח של כמויות גדולות של עוברים נגועים נעשה עם זרם חלקיקים גדול תפוקה הגבוהה cytometer. מכשיר זה יכול למיין ניתח עוברים לתוך צלחות גם רב או צלחת פטרי שהופך אותו מתאים במיוחד לבדיקת מספרים גדולים של תרכובות. אם יש צורך בהדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, מאשר ההתקנה מותאמת באופן שזרימת חלקיקים הגדול cytometer הטכנולוגיה יכולה לשמש לטרום הקרנה ולאחר מכן לנתח את הדגימות במדיום שדרךלשים ברזולוציה גבוהה יותר. ניתן לעשות זאת באמצעות הטכנולוגיה חוליות אוטומטי הקרנת 17, 18. מכשיר זה יכול באופן אוטומטי לאסוף עובר חי או קבוע בין הודעה 2 ו -7 ימי הפריה מצלחת רב גם מיכל או בתפזורת, תמונה 360 ° דרך נימים באמצעות CLSM או מיקרוסקופ סטריאו ולהשליך שוב ב2 מכולות בתפזורת המאפשרות מיון ידני של העוברים מבוססים על התמונות מיקרוסקופיות. שיפורים עתידיים יאפשר המיון של העובר לאחר ההדמיה לתוך הצלחת גם רב, ולכן מה שמאפשר למסך באופן אוטומטי מספר הגדול של עוברים בודדים לאורך זמן עם CLSM. בהנחה שביישומים עתידיים במערכת הטכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית יכולה גם להיות מחוברת לזרימה הגדולה של חלקיקי cytometer הטכנולוגיה ללא הצורך של זחלים מחלק לפני לתוך צלחות גם רב, יוביל למיון מתקדם יותר.
מאמר זה מתאר את הקמתהאופטימיזציה של ד של התקנת תפוקה גבוהה ללמוד ס epidermidis ומ ' זיהום marinum כמודל לגילוי סמים. זה מוכיח שהתוצאה של חיידקים אלו מוזרקים לתוך החלמון תלוי בשלב ההתפתחותי של הביצים בזמן הזרקה. הזרקה מ ' marinum E11 בשלב תא 16-128 או זן M בשלב תא 16-64 מוביל לאותו דפוס הזיהום כזריקת הזנב וריד 2, 6. עם זאת הגדרה זו אינה מוגבלת להתפשטות של חיידקים פתוגנים בלבד. היא הוצגה לפני שניתן להזריק רובוט פתרונות המכילים DNA, RNA או morpholinos לtransgenesis, מחקרים על ביטוי גנים ולדפוק למטה, בהתאמה 13. יתר על כן, זה היה הראה כי התקנה זו היא גם שימושית לחקר התפשטות תאי הסרטן והגירה. לכן צינור זה מציג שיטה תכליתית למסכי תפוקה גבוהה של מגוון רחב של מנגנוני איתות בהקשרשל חסינות מולדת, הוחל למחלות זיהומיות והתפתחות הסרטן. ניתן לשלב במסכים אלה עם אחרים לגילוי תרופה אבל גם עם ניתוח של השפעות רעילות אפשריות של תרופות החלים מזוהות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ליאוני דה בור והבס Zaat (מרכז רפואי אקדמי) שספק לנו ש ' זן epidermidis O-47. אנו מודים לריקו Bongaarts, פרנסיס סמט ואנג'לה Comas (איחוד Biometrica) לעזרה וייעוץ עם XL Copas וניתוח BioImager עצום. אנו מודים לדייוי דה ויט, אולריקה Nehrdich, ולורה ואן הולסט למטפל דגים, ועמיתים אחרים מאוניברסיטת ליידן לדיונים מועילים. מחקר זה מהווה חלק מפרויקט P5.03 IBIZA של תכנית המחקר של המכון ביו חומרים, שיתוף במימון המשרד ההולנדי לענייני כלכלה, ושל התכנית החכמה המיקס (NWOA_6QY9BM) של המשרד ההולנדי לענייני כלכלה ושל משרד הולנד חינוך, תרבות והמדע. תמיכה נוספות התקבלה מהפרויקט של האיחוד האירופי ZF-בריאות (FP7-בריאות 2009-242,048), וRMJ נתמכה על ידי מלגת מארי קירי כחוקר מנוסה באיחוד האירופי ההדרכה הרשת FishForPharma (PITN-GA-201 הראשוני1-289,209). SJR זכה למימון של תרופות היוזמה המשותפת ההתחייבות חדשנית תחת n הסכם מענק ° 115337, משאבים אשר מורכבים מתרומה כספית מהתכנית של האיחוד האירופי מסגרת השביעית (FP7/2007-2013) וחברות EFPIA במחברי contribution.The סוג להכיר נוסף תמיכה כספית מקרן אוניברסיטת ליידן (LUF) לרובוטיקה ומCyttron, בסבסוד תכנית Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, אשר בתורו נתמך כלכלית על ידי ארגון הולנד למחקר מדעי למתקני הדמיה. רכישת מערכת Copas נתמכה באופן חלקי על ידי האגף לכדור הארץ ומדעי חיים (alw) עם סיוע כספי מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO, 834.10.004).
Materials
| Middlebrook 7H10 agar | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 271310 | |
| BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211886 | |
| BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211887 | |
| LB agar | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L5542 | Multiple suppliers |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L3022 | Multiple suppliers |
| Chloramphenicol | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 16785.03 | Multiple suppliers |
| Hygromycin | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 25966.01 | Multiple suppliers |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | P1754 | Multiple suppliers |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Calbiochem, San Diego, California, USA | 529504 | Multiple suppliers |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | A5040 | |
| Agarose | Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands | S103 | Multiple suppliers |
| Instant ocean sea salt | Sera Marin, Heinsberg, Germany | 5460 | |
| iSPAWN | Techniplast, Buguggiate, Italy | iSPAWN | |
| Automated microinjection system | Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands | Automated microinjection system | |
| Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | COPAS XL | |
| Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | VAST BioImager | |
| LP Sampler | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | LP Sampler | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SL | |
| Injection needle 10 µm inner diameter | Qvotek, Mississauga, Canada |
References
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. , (2012).
- Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
- Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
- Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
- Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
- Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
- Chang, T. -. Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).
