Istituzione e Ottimizzazione di un programma di installazione High Throughput per studiare<em> Staphylococcus epidermidis</em> E<em> Mycobacterium marinum</em> Infezione come modello per Drug Discovery

Questi risultati mostrano che l'alta velocità conduttura per studiare S. epidermidis e M. infezione marinum è stato stabilito con successo e che potrà essere estesa ad altri modelli di infezione. In primo luogo, l'uso della grande nave allevamento (Figura 1A), basato sul sistema pubblicato da Adatto et al. (2011) 11, consente di generare un gran numero di uova sincroni in singoli eventi che consentono un elevato controllo del processo di deposizione. Accanto a poter iniettare gran numero di embrioni in un breve periodo di tempo, una versione migliorata del sistema micro-iniezione precedentemente sviluppato automatizzata 7 è stato usato (Figura 1A). Per valutare quale è la migliore fase di sviluppo per l'infezione tuorlo, iniezioni con S. epidermidis e M. marinum sono stati effettuati in tutte le diverse fasi tra 1 e 512 fase cella, secondo la descrizione fatta da Kimmel et al. (1995) 12 </sup>. Iniezioni con 100 cfu S. epidermidis tra lo stadio 16 e 128 cellule fornito il miglior modello di infezione (Figura 2). I batteri proliferavano all'interno del tuorlo per 3 giorni e si diffondono nel corpo da 3 in poi dpi. Esecuzione di iniezioni prima della fase 16 cellule che hanno portato a elevata mortalità da 4 dpi, e dopo la fase di iniezione cella 256 mostra una crescita principalmente batterica all'interno del tuorlo con quasi tutti i batteri diffondono all'interno del corpo dell'embrione. Quantificazione di carica batterica è stata effettuata mediante analisi di fluorescenza utilizzando il flusso di particelle di grandi citometro come descritto da Veneman et al. (2013) 8 (Figura 3). Le osservazioni hanno mostrato che la fase di sviluppo ottimale per l'iniezione di 30 cfu M. iniezione marinum è compresa tra 16-128 fase cella per il ceppo E11 (Figura 4A) e tra 16-64 palco cella con il M strai più virulenton (Figura 4B). Embrioni iniettati in queste fasi hanno mostrato crescita batterica all'interno del tuorlo e la diffusione dei batteri attraverso l'embrione (Figura 7). L'infezione con entrambi i ceppi in fasi precedenti ha presentato la crescita batterica generalizzata non specifica che porta gli embrioni a morire dopo 4 dpi. D'altra parte, in embrioni iniettati in fasi successive carica batterica è stata limitata al tuorlo. Avanti, presorting con ampio particelle citofluorimetro (Figura 1B) generato grandi gruppi omogenei di pesci infetti escluso embrioni non o altamente infetti (Figure 5A e 6A). Dopo presorting, M. marinum embrioni infetti sono stati trattati con Rifampicina, un farmaco di prima linea antitubercolari. Studi precedenti hanno dimostrato che il trattamento con rifampicina alla dose di 200 pM riduce efficacemente M. infezione marinum in zebrafish 7, 13. Prendendo advantage del gran numero di embrioni omogeneamente infettati generati con l'alta velocità di installazione, il trattamento con diverse dosi stata eseguita. Embrioni infettate con M. marinum M ceppo e trattate per 48 ore con 12, 24, e 200 pM rifampicina hanno mostrato di ridurre efficacemente l'infezione da micobatteri in modo dose-dipendente (Figura 5B). In vista della riduzione efficiente dell'infezione utilizzando Rifampicina alla dose di 200 pM questa concentrazione è stato usato per gli esperimenti futuri. In linea con il risultato precedente, studiare la progressione della carica batterica utilizzando M. ceppo marinum E11 una significativa riduzione 24 ore e poi dopo trattamento con 200 pM rifampicina è stato osservato (Figura 6B). Inoltre, se l'imaging alto ingrandimento è richiesto di questi embrioni, essi possono essere visualizzati automaticamente in piastre da 96 pozzetti (Figura 1C), in cui i campioni possono essere analizzati utilizzandoil sistema di Screening tecnologia Vertebrati automatizzato con il Large Particle Sampler montato su un CLSM. Il sistema di Screening tecnologia Vertebrati automatizzato con il campionatore di particelle Large è un sistema che può essere montato su un CLSM o microscopio stereo. Questo dispositivo consente il caricamento di embrioni vivi o fissi da una piastra a 96 pozzetti o contenitore bulk automaticamente attraverso un capillare di vetro, e la orienta di fronte alla telecamera con l'inclinazione desiderata (ad esempio, dorsale o laterale). Immagini dell'embrione in tutti gli orientamenti possono essere effettuate con la telecamera a bordo o con un CLSM esterno (Figura 7). Gli embrioni saranno successivamente trasferiti nel contenitore di raccolta o di rifiuti. Figura 1. Mainstream outl sperimentaleine. A) I pesci adulti sono messi insieme per accoppiarsi, le uova vengono raccolte, allineati in una piastra di agarosio e iniettato. B) Le uova iniettate sono incubate a 28 ° C e saranno pre-ordinati per possibile trattamento farmacologico. C) Analisi seguenti da grandi flusso di particelle citometro e / o Grande Particle Sampler / Vertebrate Automated Screening di tecnologia con CLSM. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Istituzione del miglior palcoscenico cellulare per S. epidermidis tuorlo d'iniezione. embrioni di zebrafish sono stati iniettati nel tuorlo a diversi stadi di sviluppo 1-512 palco cella con 100 cfu di S. epidermidis. Embrioni iniettati tra 1 and 8 stadio di cellule ha mostrato una crescita batterica nel tuorlo e l'alta mortalità da 4 dpi. Embrioni iniettati tra i 16 ei 128 stadio di cellule hanno mostrato una crescita batterica nel tuorlo e all'interno del corpo a partire da 3 dpi. Embrioni iniettati tra lo stadio 256 e 512 cellule hanno mostrato molti crescita batterica all'interno del tuorlo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. Quantificazione di carica batterica con grande flusso di particelle citometro. 100 cfu di S. epidermidis sono stati iniettati nel tuorlo di embrioni di zebrafish. A) fino a 5 dpi, ogni giorno, gruppi di 10 embrioni sono stati omogeneizzati e placcato direttamente, mostrando la crescita media esponenziale basata su due repliche biologiche (barre di errore= SEM). B) flusso di particelle Large citometro analisi mostra il segnale di media fluorescenza da non-iniettato e S. epidermidis iniettato embrioni. 30-160 embrioni per condizione sono stati analizzati (barre di errore = SEM), lettere differenti indicano differenze statisticamente significative per uno ANOVA seguito dal test di Tukey post-hoc (P <0.001), ns., Non differenze significative C) Correlazione tra cfu e segnale di fluorescenza media di gruppi di 10 S. epidermidis infetto embrioni (barre di errore = SEM). Questa cifra è stata modificata da Veneman et al. (2013) 8. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. Establishment della fase cellula migliore per M. marinum tuorlo d'iniezione. embrioni di zebrafish sono stati iniettati in tutte le diverse fasi di sviluppo 1-512 palco cella con 30 cfu di M. marinum E11 e il ceppo M. A, B) Embrioni iniettati 1-8 palco cellule ha mostrato simile diffusione e mortalità con entrambi i ceppi. A) Gli embrioni iniettati tra 16-128 palco cella con ceppo E11 ha mostrato la formazione di granulomi e le infezioni sistemiche, mentre quelli iniettato 256-512 stadio di cellule tenuto carica batterica nel tuorlo. B) Embrioni iniettato tra 16-64 palco cella con ceppo M ha mostrato la formazione di granulomi come le strutture e le infezioni sistemiche, mentre quelli iniettati 128-512 stadio di cellule tenuto carica batterica nel tuorlo . cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" fo: Content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg" /> Figura 5. Trattamento di M. infezione acuta marinum con un anti-tubercolosi farmaco di prima linea. embrioni iniettato tra 16-64 palco cella con 30 cfu di M. ceppo marinum M sono stati eseguiti attraverso la grande particella citofluorimetro a 3 dpi essere ordinati in due gruppi, dopo aver eliminato le non-e / o embrioni altamente infette. A) fluorescenza dei singoli embrioni in entrambi i gruppi. b) embrioni trattati con rifampicina (RIF ) per 48 ore a dosi di 12, 24, e 200 mM sono stati analizzati a 4 dpi; la loro carica batterica si riduce notevolmente. C) profili COPAS rappresentativi di embrioni trattati con DMSO e rifampicina a dosi di 12, 24, e 200 mM per 24 hr. Carico e distribuzione batterica viene indicato dai picchi rossi. Linea blu rappresenta il profilo dell'elemento ordinato (4 dpf zebrafish embryo) da parte dei COPAS. 60-90 embrioni per condizione sono stati analizzati. Ciascun punto di dati rappresenta un individuo embrione. I valori sono indicati come media ± SEM. ns: differenze non significative. Analisi della significatività statistica delle differenze è stata effettuata da un modo ANOVA seguito dal test di posthoc di Tukey. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 6. Trattamento di M. infezione cronica marinum con un farmaco di prima linea antitubercolari. embrioni iniettato tra 16-64 palco cella con 30 cfu di M. ceppo marinum E11 sono stati eseguiti attraverso il grande flusso di particelle citometro a 3 dpi essere ordinati in due gruppi, dopo aver eliminato le non-e / o embrioni altamente infetti. A) fluorescenza di singoli embrioni in entrambi i gruppi. B) Embrioni trattati con rifampicina (RIF) a 200 pM per 4 giorni sono stati analizzati mostra una significativa riduzione della carica batterica dopo 1 giorno di trattamento. 90 embrioni per condizione sono stati analizzati. I valori sono indicati come media ± SEM. Lettere diverse indicano differenze significative tra punti di tempo del trattamento stesso. * Indica differenze significative con il gruppo di controllo. ns: differenze non significative. Analisi della significatività statistica delle differenze è stato eseguito da un ANOVA seguita dal test di Tukey POSTHOC. (P <0.05). Figura B) è stato modificato da Spaink et al. (2013) 13. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/> Figura 7. Risultato di M. marinum E11 iniezione tuorlo ripreso con Vertebrati Automated tecnologia di screening e CLSM. confocale pila Z (cucito 3 immagini) di un 5 dpi FLI1-EGFP 14 embrioni. A) Risultati in diretta embrione mostra proliferazione di M. batteri marinum E11 (rosso) in tutto il corpo. B) Fisso 5 dpi fli-EGFP embrione mostra M. batteri marinum E11 (rosso) in tutto il corpo co-localizzazione con leucociti (azzurro) rilevata da L-plastin immunoistochimica 15.