JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em> Staphylococcus epidermidis</em> En<em> Mycobacterium marinum</em> Infectie als een model voor Drug Discovery

Published: June 26, 2014
doi:
10.3791/51649
, , , , , ,
1Institute of Biology,Leiden University, 2ZF-screens BV, 3Life Science Methods BV

Summary

Deze video artikel beschrijft de high throughput pijpleiding die is met succes tot infectie en analyseren van grote aantallen zebravis embryo's die een nieuw krachtig hulpmiddel voor beproeving en drug discovery met geheel gewerveld organisme.

Abstract

Zebravis worden steeds een waardevol instrument in de preklinische fase van drug discovery screenings als geheel diermodel met high throughput screening mogelijkheden. Ze kunnen worden gebruikt om de afstand tussen celgebaseerde proeven eerdere fasen en in vivo validatie overbruggen zoogdiermodellen, verminderen, aldus, het aantal verbindingen dat door het testen op de veel duurdere diermodellen. In dit licht in dit manuscript wordt beschreven een nieuwe high throughput pijpleiding zebravis als in vivo model voor de studie van Staphylococcus epidermidis en Mycobacterium marinum infectie. Daarmee kan het genereren en analyseren van grote aantallen synchrone embryo homogeen geïnfecteerd. Bovendien is de flexibiliteit van de leiding kan de gebruiker gemakkelijk te implementeren andere platformen om de resolutie van de analyse te verbeteren wanneer nodig. De combinatie van de zebravis, samen met innovatieve high throughput technologies opent het veld testen van geneesmiddelen en ontdekking van nieuwe mogelijkheden niet alleen vanwege de sterkte van het gebruik geheel diermodel maar ook vanwege het grote aantal transgene lijnen die kunnen worden gebruikt om het werkingsmechanisme van nieuwe samenstellingen ontcijferen.

Introduction

De zebravis heden (Danio rerio) werd met succes een efficiënt model van verschillende infectieziekten 1 bestuderen. De zebravis embryo biedt uniek in vivo beeldvorming mogelijkheden vanwege hun transparantie en het grote aantal bestaande transgene reporter lijnen uiten van fluorescerende eiwitten. Deze krachtige combinatie maakt het mogelijk verschillende immuunceltypen volgen in de tijd tijdens de interactie met pathogenen, zoals Mycobacterium marinum, de naaste verwant van M. tuberculose 2 of Staphylococcus epidermidis, de belangrijkste veroorzaker van biomateriaal geassocieerde infectie 3-5. Verschillende routes van infectie kan worden gebruikt in zebravis embryo afhankelijk van het doel van het onderzoek 6.

Een van deze infectie routes dooier injectie van de bacteriën. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van de anderen is dat dooier infectiop automatisch via robot injectie worden uitgevoerd, omdat er minder injectietijd en waardoor hoge reproduceerbaarheid van de infectie 7, 8.

Contract, met de zebravis als hoge doorvoer in vivo model voor de studie van S. epidermidis en M. marinum infectie toonden de succesvolle 7, 8 te zijn. Dit systeem is in staat om te screenen op ziekteprogressie via robotachtige dooier injectie van vroege embryo's en met behulp van fluorescentie uitlezing als maat voor de bacteriële verontreiniging. In overeenstemming met deze gedachte is deze opstelling geoptimaliseerd en is een zeer efficiënte high throughput leiding met de mogelijkheid om grote aantallen homogeen geïnfecteerde embryo genereren en bijhouden van de progressie van de infectie in de tijd na behandeling met verschillende verbindingen. Met de vastgestelde opstelling is het mogelijk genereren tot 8000 synchrone embryo screenenziekteprogressie, verwerking op deze manier tot 2500 embryo's per uur. Embryo's worden gesorteerd op basis van hun bacteriële verontreiniging een geautomatiseerd systeem, zodat homogene groepen geïnfecteerde larven. Teneinde voorts de installatie valideren effecten verwijzing bekende tuberculose progressie bij zoogdieren voorkomen getest op embryo's geïnfecteerd met M. marinum E11 stam of de meer virulente stam M 9.

Deze studie beschrijft in detail de high throughput pijpleiding deze bestaat kunnen grote aantallen geïnfecteerde embryo en de daaropvolgende analyse van de bacteriële progressie tijdens de ontwikkeling en na behandeling met verbinding genereren.

Protocol

1. Bacteriestammen en Groei voorwaarden Bereid S. epidermidis Inoculum Haal een paar individuele kolonies van S. epidermidis stam O-47, bevattende een pWVW189 afgeleid mCherry expressievector (De Boer L. gepubliceerd) een Luria Bertani (LB) agar platen gesupplementeerd met 10 ug / ml chlooramfenicol en kweek overnacht bij 37 ° C in 25 ml LB medium aangevuld met 10 ug / ml chlooramfenicol te Midlog podium. Centrifugeer 1 ml van de kweek bij 12.000 xg gedurende 1 min en vervolgens 3x wassen met 1 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,3% (v / v) Tween-80. Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600), en verdun de bacteriesuspensie een OD600 van 0,3 in 2% (w / v) polyvinylpyrrolidon 40 (pvp 40) in PBS. Opmerking: Een OD 600 van 0,3 komt overeen met 1,0 x 10 8 kolonievormende eenheden / ml (cfu / ml). </ol> Bereid M. marinum Inoculum Haal een paar individuele kolonies van M. marinum stam M of E11 met de pSMT3-mCherry vector stabiel tot expressie mCherry 10 uit een Middlebrook 7H10 agar plaat met 10% (v / v) Middlebrook OADC verrijking aangevuld met 50 ug / ml overnacht hygromycine en cultuur bij 28 ° C in 10 ml Middlebrook 7H9 bouillon met 10% (v / v) Middlebrook ADC verrijking aangevuld met 50 ug / ml hygromycine. Centrifugeer 1 ml van de kweek bij 12.000 xg gedurende 1 min en vervolgens 3x wassen met 1 ml steriele PBS met 0,3% (v / v) Tween-80. Meet de OD 600, en verdun de bacteriesuspensie een OD600 van 0,3 in 2% (w / v) pvp 40 in PBS. Opmerking: Een OD600 van 1 komt overeen met 1,0 x 10 8 cfu / ml. 2. Bereid zebravis Eieren Plaats maximaal 70 mannelijke en 50 vrouwelijke wild type zebravis afzonderlijk in de grote fokkerij schip. Let op: Plaats de vrouwelijke vis in het onderste deel van de grote fokkerij schip. Verwijder de afscheider de volgende dag in de ochtend, laat de zebravis broeden. Verzamel de eieren op de bodem van de grote kweek vat door het ei collector in een 50 ml buis gevuld met ei water (60 ug / ml direct oceaan zeezout). 3. Injectienaalden Verkrijgen commercieel beschikbare maat naalden glas capillairen met een inwendige diameter van 10 urn. 4. Experimentele Overzicht van Injection Kook 100 ml 1% (w / v) agarose in ei water en laat afkoelen tot ongeveer 40 ° C. Giet agarose in de geautomatiseerde microinjectors bord en plaats de 1024-en stempel in de agarose. Opmerking: De plaat is klaar voor gebruik als afgekoeld. Op de geautomatiseerde microinjector besturingssoftware klik op 'kalibreren stage',klik dan op '1024 'goed rooster en plaats de agarose plaat in de microinjector en kalibreren van de plaat door te klikken op het scherm op de middenpositie van de put. Ga naar 'naald menu' en klik op 'kalibreren naaldhouder'. Vul de injectienaald met een microloader tip met ofwel 10 pl pvp 40 met 100 kve / nl S. epidermidis of 30 kve / nl M. marinum, of het gebruik pvp 40 als mock injectie. Plaats de naald in de geautomatiseerde micro-injector en kalibreren van de x, y-positie door het verlagen of het verplaatsen van de naald omhoog en klikken op het scherm op de positie van de naald. Kalibreren dan de z-positie van de naald door te klikken op het scherm op de positie van de punt van de naald. Verdeel de eieren over de agarose raster met een plastic overdracht pipet en verwijder overtollig ei water. Plaats de agarose raster in het geautomatiseerde microinjector. Ga naar de 'injection menu 'en pas de' Inspuitdruk 'instelling tot 200 hPa,' Injection time '0,2 sec en' Compensation druk '15 hPa, die correleert met 1 nl, bij het menu Femtojet instellingen. Klik op 'Spuit alle' om de hele plaat te injecteren. Verzamel de eieren na injectie door wassen in een petrischaal (92 x 16 mm), met een maximum van 70 embryo's per petrischaal en incubeer bij 28 ° C. 5. Flow-cytometer Analyse Bereid de grote deeltjes stromingscytometer volgens de instructies van de fabrikant en vult u het monster beker en mantelvloeistof container met ei water. Op de besturingssoftware, ga naar het menu 'PMT' en gebruik de volgende instellingen: 650 V voor de 'Red' channel en 0 V voor de 'Groen' en 'Yellow' kanalen. Ga dan naar 'Drempels' menu en gebruik de volgende instellingen: 'Optical dichtheid 'drempelsignaal: 975 mV (COPAS XL waarde: 50) en de' Time Of Flight '(TOF) minimaal 320 msec (COPAS XL waarde: 800) om de invloed van vuil te verminderen. Voor de analyse ongesorteerd het embryo naar stap 5.4 voor analyse en sorteren van de embryo's in een petrischaal naar stap 5.5 of analyse en sorteren van de embryo's in een plaat met 96 putjes naar stap 5.6. Plaats de embryo's in de steekproef beker en klik op 'start' om de analyse te starten. Als alle embryo's worden geanalyseerd stoppen de analyse door te klikken op 'stop'. Sla de gegevens op door te klikken op 'Store all'. Opmerking: Alle gegevens worden opgeslagen als TXT, LMD, DAT, CSV en BSRT bestanden. Volg het protocol bij stap 5.7. Plaats de embryo's in de steekproef beker en het maximum van 70 embryo's per plaat worden opgelost door het invoeren van 70 in het menu 'Sorteren' definiëren. Plaats een lege petrischaal onder de sorteerder en klik op 'Handmatig Sorteren'. Wanneer de Petri di sh is gevuld, de gegevens opslaan door te klikken op 'Store all'. Opmerking: Alle gegevens worden opgeslagen als TXT, LMD, DAT, CSV en BSRT bestanden. Volg het protocol bij stap 5.7. Plaats de embryo's in de steekproef beker en het maximum van 1 embryo per goed worden opgelost door het invoeren van 1 in het menu 'Sorteren' definiëren. Plaats een lege 96-wells plaat in de linker plaat houder en klik op 'Fill plaat'. Toen de 96-well plaat is gevuld, de gegevens opslaan door te klikken op 'Store all'. Opmerking: Alle gegevens worden opgeslagen als TXT, LMD, DAT, CSV en BSRT bestanden. Volg het protocol bij stap 5.7. Verkrijg de TXT-bestand om de ruwe data te verwerken, gebruikt u de volgende gegevens filter instellingen: 'Status selecteer': 40, en bij gebruik van het soort module 'Status soort':. 6 Gebruik vervolgens de nummers van de totale fluorescentie-signaal van de 'Red 'kanaal naar de gemiddelde en de standaardafwijking van het gemiddelde te berekenen. Plot deze datasets in bar of spreidingsgrafieken. ve_title "> 6. Drug Treatment Analyseer en sorteer op 3 dagen na de injectie (dpi), M. marinum geïnfecteerde embryo's in twee gelijke groepen met behulp van de grote deeltjes stromingscytometer (stap 5.5). Behandel een groep met een verbinding van belang in de drager oplosmiddel en andere transportgas oplosmiddel alleen (controle). Gelden soortgelijke behandelingen om ingespoten controle bespotten om test voor antibiotica bijwerkingen. Herhaal op 4 en 5 dpi de analyse (stap 5.5) en vernieuw de ei water of ei water met de verbinding. 7. High Resolution Imaging Verdoven van de embryo's met 0,02% (w / v) gebufferde 3-aminobenzoëzuur ethyl ester (tricaïne) in ei water 10 minuten voor analyse. Bereid de Gewervelde Automated Screening Technology systeem en de Large Particle Sampler volgens de instructies van de fabrikant. Selecteer de referentiebeelden die overeenkomt met de leeftijd van de embryo's uit de 'Imaging – Object211; Detectie Setup menu '. Selecteer de hoeveelheid foto's en oriëntatie te worden gemaakt door de gewervelde Automated Screening Technology systeem van de 'Imaging – beelden automatisch opslaan' menu. Plaats een 96-well plaat gevuld met embryo's (uit stap 5.6) in de linker plaat houder van de Large Particle Sampler, en klik op 'Run plaat'. Wanneer een embryo wordt gedetecteerd en de juiste positie; het imago van de kop en de staart los met de CLSM met een 10X vlakte droog objectief en steek de opnamen die daarna met behulp van software voor beeldverwerking.

Representative Results

De huidige resultaten tonen aan dat de hoge doorvoer pijpleiding S. bestuderen epidermidis en M. marinum infectie met succes vastgesteld en kan worden uitgebreid tot andere infectiemodellen. Ten eerste is het gebruik van de grote kweek vat (figuur 1A), op basis van het gepubliceerde systeem Adatto et al.. (2011) 11, zodat grote aantallen synchrone eieren genereren afzonderlijke onderdelen bieden een hoge beheersing van de paai proces. Daarnaast kunnen grote aantal embryo injecteert een korte tijd, een verbeterde versie van de eerder ontwikkelde geautomatiseerde micro-injectiesysteem 7 werd gebruikt (figuur 1A). Om te beoordelen wat de beste ontwikkelingsstadium voor dooier infectie, injecties met S. epidermidis en M. marinum werden uitgevoerd bij alle stadia tussen 1 en 512 cellig stadium, volgens de beschrijving die Kimmel et al.. (1995) 12 </sup>. Injecties met 100 kve S. epidermidis tussen de 16 en 128 celstadium voorwaarde dat de beste infectie patroon (figuur 2). De bacteriën verspreidden zich in de dooier voor 3 dagen en verspreiden in het lichaam van 3 dpi verder. Uitvoeren injecties voor de 16 cel stadium leidde tot een hoge mortaliteit bij 4 dpi, en injectie na de 256 cellig stadium hebben voornamelijk bacteriegroei in de dooier met nauwelijks bacteriën verspreiding in het lichaam van het embryo. Kwantificering van bacteriële belasting werd uitgevoerd door fluorescentie-intensiteit analyse met behulp van grote deeltjes flowcytometer zoals beschreven door Veneman et al.. (2013) 8 (figuur 3). Zij toonden aan dat de optimale ontwikkelingsstadium voor injectie van 30 cfu M. marinum injectie is tussen 16-128 cel podium voor de E11 stam (Figuur 4A) en tussen 16-64 cel podium met de meer virulente M strain (Figuur 4B). Embryo geïnjecteerd bij deze fasen liet bacteriegroei in de dooier en verspreiding van de bacteriën via de embryo (figuur 7). Infectie met beide stammen in eerdere stadia gepresenteerd aspecifieke algemene groei van bacteriën waardoor de embryo's sterven na 4 dpi. Anderzijds, in embryo geïnjecteerd in latere bacteriële belasting werd beperkt tot de dooier. Vervolgens voorsortering met grote deeltjes stromingscytometer (Figuur 1B) genereerden grote homogene groepen van besmette vis met uitzondering van niet-of zeer geïnfecteerde embryo's (figuren 5A en 6A). Na voorsortering, M. marinum geïnfecteerde embryo's werden behandeld met rifampicine, een eerste lijn antituberculose drug. Eerdere studies toonden aan dat behandeling met rifampicine in een dosering van 200 uM efficiënt vermindert M. marinum infectie in de zebravis 7, 13. Nemen advantage van het grote aantal geïnfecteerde embryo homogeen gemaakt met de hoge doorvoer opstelling behandeling met verschillende doses uitgevoerd. Embryo's die besmet zijn met M. M marinum stam en gedurende 48 uur met 12, 24 en 200 uM Rifampicine bleek efficiënt mycobacteriële infectie op een dosis afhankelijke wijze (Figuur 5B). Gezien de efficiënte vermindering van de besmetting met rifampicine in een dosering van 200 uM deze concentratie werd gebruikt voor toekomstige experimenten. In lijn met het vorige resultaat, het bestuderen van bacteriële last progressie met behulp van M. marinum stam E11 een significante vermindering 24 uur en verder na behandeling met 200 uM Rifampicine waargenomen (Figuur 6B). Bovendien, als sterke vergroting beeldvorming vereisen van deze embryo's, kunnen ze worden automatisch in 96-well platen (figuur 1C), waar de monsters kunnen worden geanalyseerd met behulpde Gewervelde Geautomatiseerde Screening Technology systeem met de Large Particle Sampler gemonteerd op een CLSM. De Vertebrate geautomatiseerde screening technisch systeem met de grote deeltjes Sampler is een systeem dat hetzij op een CLSM of stereomicroscoop worden gemonteerd. Dit apparaat maakt het laden van levende en vaste embryo's van een 96-well plaat of bulkcontainers automatisch door een glazen capillair, en oriënteert het voor de camera op de gewenste hoek (bijv. dorsale of laterale). Beelden van het embryo in alle oriëntaties kan worden gemaakt met het ingebouwde camera of met een externe CLSM (figuur 7). Embryo's worden vervolgens overgedragen in de collectie of afvalcontainer. Figuur 1. Mainstream experimentele outline. A) Volwassen vissen worden in elkaar gezet om te paren, eieren worden verzameld, uitgelijnd in een agarose plaat en geïnjecteerd. B) De geïnjecteerde eieren worden uitgebroed op 28 ° C en wordt voorgesorteerd voor mogelijke behandeling met geneesmiddelen. C) Na analyse door grote deeltje stromingscytometer en / of grote deeltjes Sampler / gewervelde Automated Screening Technology met CLSM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2. Vaststelling van de beste mobiele podium voor S. epidermidis dooier injectie. zebravis embryo's werden geïnjecteerd in de dooier in verschillende ontwikkelingsstadia 1-512 cel podium met 100 kve van S. epidermidis. Embryo geïnjecteerd tussen 1 and 8 cellen stadium toonde bacteriegroei in de dooier en de hoge mortaliteit van 4 dpi. Embryo geïnjecteerd tussen 16 en 128 cellig stadium toonde bacteriegroei in de dooier en in het lichaam vanaf 3 dpi. Embryo geïnjecteerd tussen 256 en 512 cellen stadium toonde veel bacteriegroei in de dooier. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3. Kwantificering van bacteriële last met behulp van grote deeltjes doorstroomcytometer. 100 kve van S. epidermidis werden geïnjecteerd in de dooier van zebravis embryo's. A) tot 5 dpi, elke dag, groepen van 10 embryo's waren gehomogeniseerd en direct verzilverd zien in een gemiddelde exponentiële groei op basis van twee biologische replica (error bars= SEM). B) Grote deeltje stroomcytometer analyse blijkt de gemiddelde fluorescentie-signaal van niet-geïnjecteerde en S. epidermidis geïnjecteerde embryo. 30-160 embryo per conditie werden geanalyseerd (error bars = SEM), verschillende letters geven statistisch significante verschillen met een ANOVA gevolgd door Tukey post-hoc-test (P <0.001), ns:. Geen significante verschillen C) Correlatie tussen kve en gemiddelde fluorescentie-signaal van groepen van 10 S. epidermidis geïnfecteerd embryo (error bars = SEM). Dit cijfer is aangepast Veneman et al.. (2013) 8. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4. Establishment van de beste mobiele podium voor M. marinum dooier injectie. zebravis embryo's werden geïnjecteerd in alle verschillende stadia van de ontwikkeling 1-512 cel podium met 30 kve van M. marinum E11 en M stam. A, B) Embryo geïnjecteerd 1-8 cel stadium toonde vergelijkbare verspreiden en mortaliteit met beide stammen. A) Embryo geïnjecteerd tussen 16-128 cel podium met E11 stam toonde vorming van granulomen en systemische infectie terwijl die geïnjecteerd 256-512 cel stadium gehouden bacteriële last in de dooier. B) Embryo geïnjecteerd tussen 16-64 cel podium met M stam toonde vorming van granulomen achtige structuren en systemische infectie terwijl die geïnjecteerd 128-512 cel stadium gehouden bacteriële last in de dooier . Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 5" fo: Content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg" /> Figuur 5. Behandeling van M. marinum acute infectie met een eerste-lijn anti-tuberculose drug. Embryo geïnjecteerd tussen 16-64 cel podium met 30 kve van M. M marinum stam werden doorgenomen grote deeltjes flowcytometer 3 dpi worden gesorteerd in twee groepen na weggooien van de niet-en / of zeer geïnfecteerde embryo. A) Fluorescentie van afzonderlijke embryo's in beide groepen. B) Embryo behandeld met rifampicine (RIF ) gedurende 48 uur bij doses van 12, 24 en 200 uM werden geanalyseerd op 4 dpi; de bacteriële belasting wordt sterk verminderd. C) Representatieve COPAS profielen embryo's behandeld met DMSO en rifampicine bij doses van 12, 24 en 200 uM gedurende 24 uur. Bacteriologische belasting en distributie wordt aangegeven door de rode pieken. Blauwe lijn vertegenwoordigt het profiel van het element gesorteerd (4 dpf zebravis embryo) door de COPAS. 60-90 embryo's per conditie werden geanalyseerd. Elk data punt vertegenwoordigt een individueel embryo. De waarden worden aangegeven als gemiddelde ± SEM. ns: niet significant verschillen. Analyse van de statistische significantie van verschillen werd uitgevoerd door een ANOVA gevolgd door Tukey posthoc test. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6. Behandeling van M. marinum chronische infectie met een eerste lijn antituberculosis drug. Embryo geïnjecteerd tussen 16-64 cel podium met 30 kve van M. marinum E11 stam werden uitgevoerd door middel van de grote deeltjes flowcytometer op 3 dpi gesorteerd worden in twee groepen na afdanking van het niet-en / of sterk geïnfecteerde embryo's. A) Fluorescentie van afzonderlijke embryo's in beide groepen. B) Embryo behandeld met rifampicine (RIF) en 200 uM gedurende 4 dagen werden geanalyseerd met een aanzienlijke vermindering van de bacteriële lading na 1 dag behandeling. 90 embryo's per conditie werden geanalyseerd. De waarden worden aangegeven als gemiddelde ± SEM. Verschillende letters geven significante verschillen tussen de tijdstippen van dezelfde behandeling. * Geeft significante verschillen met controlegroep. ns: niet significant verschillen. Analyse van de statistische significantie van verschillen werd uitgevoerd door een ANOVA gevolgd door Tukey posthoc test. (P <0,05). Figuur B) is gewijzigd van Spaink et al.. (2013) 13. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/> Figuur 7. Resultaat van M. marinum E11 dooier injectie afgebeeld met behulp van gewervelde Geautomatiseerde Screening Technology en CLSM. confocale Z-stack (gestikt 3 foto's) van een 5 dpi FLI1-EGFP 14 embryo. A) Live-embryo vertoning proliferatie van M. marinum E11 bacteriën (rood) door het hele lichaam. B) Vaste 5 dpi FLI-EGFP embryo waaruit M. marinum E11 bacteriën (rood) door het hele lichaam co-lokalisatie met leukocyten (lichtblauw) gedetecteerd door L-plastin immuunkleuring 15.

Discussion

De in dit document beschreven high throughput methode biedt een snelle en kosteneffectieve pijpleiding naar grote aantal vissen embryo's en larven screenen met verschillende soorten infecties. Met behulp van de grote fokkerij vaartuig in plaats van traditionele single of familie kweekbakken vergemakkelijkt de controle van de paai-proces en het genereren van een groter aantal synchrone eieren. Met een verbeterde versie van de geautomatiseerde micro-injectiesysteem 7, is het mogelijk te injecteren tot 2500 eieren bijna allemaal in dezelfde cel stadium binnen 1 uur. Met deze updates en verbeterde software is het mogelijk om meer eieren dan voorheen mogelijk was die kan worden gebruikt om grote drugschermen voeren met bacteriële proliferatie als uitgelezen injecteren. Maar deze methode is nog steeds beperkt tot de injectie, andere injectie routes bijvoorbeeld beschreven door Benard et al. dooier. (2012) 6, zal hopelijk in de geautomatiseerde micro-injectie systeem worden opgenomen in de nabije toekomst.

<p class = "jove_content"> Hoewel deze methoden worden vergeleken voor het screenen van de zebravis, zou het nuttig zijn voor toepassingen met andere vissoorten als goed. Zo heeft de karper is aangegeven om voordelen voor drug-schermen. Zoals zebravis, eieren en jonge embryo's van karper zijn transparant, maar met het belangrijkste voordeel van de grote kuit omvang van honderdduizenden eieren en de beschikbaarheid van inteelt lijnen die een meer constante genetische achtergrond 16 bieden.

De analyse van grote hoeveelheden van geïnfecteerde embryo gebeurt met hoge doorvoer grote deeltjes flowcytometer. Dit apparaat kan sorteren geanalyseerd embryo's in multi-well platen of een petrischaal waardoor het bijzonder geschikt voor het testen van grote aantallen verbindingen. Indien een hogere beeldresolutie nodig dan de installatie is aangepast zodanig dat de grote deeltjes flowcytometer technologie kan worden gebruikt voor pre-screening en vervolgens analyseren van de monsters op een mediumzetten met een hogere resolutie. Dit kan gedaan worden met behulp van de gewervelde Automated Screening Technology 17, 18. Dit apparaat kan automatisch verzamelen live-of vaste embryo's tussen 2 en 7 dagen na de bevruchting van een multi-well plaat of bulkgoederen, van het 360 ° door een capillaire behulp CLSM of stereo-microscopie en gooi opnieuw in 2 bulkcontainers waardoor handmatig sorteren van de embryo's op basis de microscopische beelden. Toekomstige verbeteringen het sorteren van het embryo na de beeldvorming in de multi well plaat mogelijk, waardoor het dus mogelijk om automatisch groot aantal individuele embryo scherm tijd met CLSM. Ervan uitgaande dat toekomstige toepassingen de gewervelde Automatische Screening technologie kan ook worden aangesloten op de grote deeltjes flowcytometer technologie zonder voorafgaande afgifte larven in multi putjes, zal leiden tot een meer geavanceerde sortering.

Dit document beschrijft de totstandkoming van eend optimalisatie van een high throughput setup om S. studeren epidermidis en M. marinum infectie als model voor drug discovery. Het toont aan dat de resultaten van deze bacteriën geïnjecteerd in de dooier afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van de eieren op het moment van injectie. Het injecteren van M. marinum E11 bij 16-128 cel podium of de M spanning bij 16-64 cel stadium leidt tot dezelfde infectie patroon als staartveine injectie 2, 6. Deze opstelling is echter niet beperkt tot de verspreiding van enige bacteriële pathogenen. Het is eerder aangetoond dat het mogelijk is om een robot te injecteren oplossingen die DNA, RNA of morpholinos voor transgenese, over-expressie en gen knock-down studies, respectievelijk 13. Verder werd aangetoond dat deze opstelling is ook nuttig voor het bestuderen van kanker celproliferatie en migratie. Daarom is deze pijpleiding presenteert een veelzijdige werkwijze voor high throughput screens van verschillende signaal mechanismen in de contextvan aangeboren immuniteit, toegepast infectieziekten en de ontwikkeling van kanker. Deze schermen kunnen worden gecombineerd met anderen geneesmiddel ontdekking maar ook analyse van mogelijke toxische effecten van geïdentificeerde toepassing drugs.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn dankbaar voor Leonie de Boer en Bas Zaat (Academisch Medisch Centrum) voor het verstrekken van ons met de S. epidermidis O-47 stam. Wij danken Rico Bongaarts, Francis Smet en Angela Comas (Union Biometrica) voor hulp en advies bij de COPAS XL en VAST BioImager analyse. Wij danken Davy de Witt, Ulrike Nehrdich en Laura van Hulst voor vissen conciërges, en andere collega's van de Universiteit Leiden voor nuttige discussies. Dit onderzoek maakt deel uit van het Project P5.03 IBIZA van het onderzoeksprogramma van het BioMedical Materials instituut, mede gefinancierd door het Nederlandse Ministerie van Economische Zaken, en van de Smart Mix-programma (NWOA_6QY9BM) van Nederland Ministerie van Economische Zaken en van De Nederland Ministerie van Onderwijs, Cultuur en Wetenschap. Extra steun werd verkregen van het EU-project ZF-Health (Gezondheid FP7-2009-242048), en RMJ werd ondersteund door Marie Curie-beurs als voor ervaren onderzoekers in de EU Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289209). SJR ontving gelden van het Innovative Medicines Initiative gemeenschappelijke onderneming onder subsidieovereenkomst nr. 115.337, middelen van die zijn samengesteld uit de financiële bijdrage van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (FP7/2007-2013) en EFPIA bedrijven in natura contribution.The auteurs erkent verder financiële steun van het Leids Universiteits Fonds (LUF) voor robotica en uit Cyttron, in het Besluit Subsidies Investeringen Kennisinfrastructuur programma, dat op zijn beurt wordt financieel ondersteund door de Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek voor imaging faciliteiten. De COPAS systeem overname werd gedeeltelijk ondersteund door het gebied Aard-en Levenswetenschappen (ALW) met financiële steun van de Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO, 834.10.004).

Materials

Middlebrook 7H10 agar BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 262710
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 271310
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211886
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211887
LB agar Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L5542 Multiple suppliers
LB broth Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L3022 Multiple suppliers
Chloramphenicol Bio-connect, Huissen, the Netherlands 16785.03 Multiple suppliers
Hygromycin Bio-connect, Huissen, the Netherlands 25966.01 Multiple suppliers
Tween-80 Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA P1754 Multiple suppliers
Polyvinylpyrrolidone40 Calbiochem, San Diego, California, USA  529504 Multiple suppliers
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA A5040
Agarose Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands S103 Multiple suppliers
Instant ocean sea salt Sera Marin, Heinsberg, Germany 5460
iSPAWN Techniplast, Buguggiate, Italy iSPAWN
Automated microinjection system Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands Automated microinjection system
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA COPAS XL
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA VAST BioImager
LP Sampler Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA LP Sampler
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SL
Injection needle 10 µm inner diameter Qvotek, Mississauga, Canada
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
  3. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
  4. Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
  5. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
  6. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. , (2012).
  7. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  8. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  9. Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
  10. Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
  11. Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
  12. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  13. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  14. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
  15. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  16. Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
  17. Chang, T. -. Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
  18. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).

Tags

ZebrafishHigh ThroughputDrug DiscoveryStaphylococcus EpidermidisMycobacterium MarinumInfection ModelPreclinical ScreeningIn Vivo ModelTransgenic Lines

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Veneman, W. J., Marín-Juez, R., de Sonneville, J., Ordas, A., Jong-Raadsen, S., Meijer, A. H., Spaink, H. P. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), e51649, doi:10.3791/51649 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image