Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em> Staphylococcus epidermidis</em> E<em> Mycobacterium marinum</em> Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

Os resultados deste estudo mostram que o gasoduto de transferência de alta para estudar S. epidermidis e M. infecção marinum foi estabelecida com sucesso e que pode ser estendida a outros modelos de infecção. Em primeiro lugar, o uso de um grande vaso de criação (Figura 1A), com base no sistema publicada por Adatto et al. (2011) 11, permite a geração de grandes números de ovos síncronos em eventos individuais que proporcionam um elevado controlo do processo de desova. Em seguida ser capaz de injectar grande número de embriões num curto período de tempo, foi utilizada uma versão melhorada do sistema automatizado anteriormente desenvolvido micro-injecção 7 (Figura 1A). Para avaliar qual é a melhor fase de desenvolvimento para a infecção gema, injeções com S. epidermidis e M. marinum foram realizadas em todas as diferentes fases de entre 1 e 512 fase celular, de acordo com a descrição feita por Kimmel et al. (1995) 12 </sup>. Injeções com 100 ufc S. epidermidis entre a fase 16 e 128 células, desde que o melhor padrão de infecção (Figura 2). As bactérias proliferam no interior da gema por 3 dias e se espalhou para o corpo a partir de 3 dpi em diante. Realizando injecções antes da etapa de 16 células conduziu à elevada taxa de mortalidade de 4 dpi, e depois da fase de injecção de células 256 apresentaram crescimento bacteriano, principalmente no interior da gema com quase todas as bactérias propagação no interior do corpo do embrião. Quantificação da carga bacteriana foi realizada por análise de intensidade de fluorescência usando o fluxo de partícula grande citómetro como descrito por Veneman et al. (2013) 8 (Figura 3). As observações mostraram que o estádio de desenvolvimento ideal para a injecção de 30 CFU M. injecção marinum é entre 16 a 128 fase da célula para a estirpe E11 (Figura 4A) e entre 16-64 fase célula com o M strai mais virulenton (Figura 4B). Os embriões injectados nestas fases mostrou o crescimento bacteriano dentro da gema e propagação das bactérias através do embrião (figura 7). A infecção com ambas as cepas em fases anteriores apresentaram crescimento bacteriano generalizada inespecífica levando os embriões a morrer depois de 4 dpi. Por outro lado, em embriões injectados em fases posteriores da carga bacteriana foi restrita à gema. Em seguida, pré-triagem com grande partícula citometria de fluxo (Figura 1B) gerou grandes grupos homogéneos de peixes infectados excluindo embriões não-ou altamente infectados (figuras 5A e 6A). Depois de pré-ordenação M. embriões infectados marinum foram tratados com rifampicina, um fármaco de primeira linha anti-tuberculose. Estudos anteriores demonstraram que o tratamento com rifampicina numa dose de 200 uM reduz eficientemente M. marinum infecção em peixes-zebra 7, 13. Tomando advantage do grande número de embriões homogeneamente infectadas gerados com o elevado rendimento de configuração, o tratamento com doses diferentes foi realizada. Os embriões infectados com M. M marinum estirpe e tratados durante 48 horas com 12, 24, e 200 uM Rifampicina mostrou reduzir a infecção por micobactérias eficiente de uma forma dependente da dose (Figura 5B). Tendo em vista a redução eficiente da infecção utilizando rifampicina numa dose de 200 uM esta concentração foi usada para as futuras experiências. Em linha com o resultado anterior, estudando progressão carga bacteriana usando M. marinum E11 tensão uma redução significativa de 24 horas em diante após o tratamento com 200 mM Rifampicina foi observado (Figura 6B). Além disso, se a imagem de alta ampliação é necessária destes embriões, podem ser exibidos automaticamente em placas de 96 poços (Figura 1C), a partir dos quais as amostras podem ser analisadas usandoo sistema de Tecnologia de Triagem de Vertebrados automatizado com o Grande Particle Sampler montado em um CLSM. O sistema de Tecnologia de Triagem de Vertebrados automatizado com o Grande Particle Sampler é um sistema que pode ser montado em um CLSM ou microscópio estéreo. Este dispositivo permite o carregamento de embriões vivos ou fixas a partir de uma placa de 96 poços ou recipiente de volume automaticamente por meio de um capilar de vidro, e orienta-o em frente da câmara para o ângulo desejado (por exemplo, dorsais ou laterais). Imagens do embrião em todas as orientações podem ser feitos com a câmara na placa ou com um CLSM externa (Figura 7). Os embriões serão posteriormente transferidos na coleção ou resíduos recipiente. Figura 1. Outl experimental Mainstreamine. A) peixes adultos são colocados juntos para acasalar, os ovos são recolhidos, alinhados em uma placa de agarose e injectado. B) Os ovos injectados são incubados a 28 ° C e irá ser pré-ordenada para possível tratamento da toxicodependência. C) A análise posterior por grande fluxo de partículas citômetro e / ou Grande Particle Sampler / Vertebrate Tecnologia Triagem Automatizada com CLSM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Estabelecimento de melhor estágio de célula para S. epidermidis gema injeção. embriões Zebrafish foram injetados na gema em diferentes estágios de desenvolvimento de 1 a 512 estágio de célula com 100 ufc de S. epidermidis. Embriões injetados entre 1 a8 ª etapa células apresentaram crescimento bacteriano na gema e elevada mortalidade de 4 dpi. Os embriões injectados entre 16 e 128 estágio celular mostraram crescimento bacteriano na gema e no interior do corpo a partir de 3 dpi. Embriões injetados entre fase 256 e 512 células mostraram muitos o crescimento bacteriano no interior da gema. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. Quantificação da carga bacteriana usando o grande fluxo de partículas citômetro. 100 ufc de S. epidermidis foram injectadas na gema de embriões de peixes-zebra. D) até 5 dpi, cada dia, os grupos de 10 embriões foram homogeneizados e plaqueados directamente, mostrando o crescimento exponencial média, com base em duas réplicas biológicas (barras de erro= SEM). B) Grande fluxo de partículas citômetro análise mostra o sinal de fluorescência média de não-injetado e S. epidermidis injetado embriões. Foram analisados ​​30-160 embriões por condição (barras de erro = SEM), letras diferentes indicam diferença significativa pelo one way ANOVA seguido pelo teste de Tukey post-hoc (P <0,001), ns:. Não diferenças significativas C) Correlação entre ufc e sinal de fluorescência média de 10 grupos de S. epidermidis infectado embriões (barras de erro = SEM). Este valor foi modificado a partir Veneman et al. (2013) 8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Establishment da melhor fase da célula para M. marinum gema de injeção. embriões Zebrafish foram injetados em todos os diferentes estágios de desenvolvimento de 1 a 512 estágio de célula com 30 ufc de M. marinum E11 e M tensão. A, B) Embriões injetados 1-8 estágio de célula mostrou semelhante espalhando e mortalidade com as duas cepas. A) Embriões injetados entre 16-128 estágio de célula com E11 cepa mostrou formação de granulomas e infecção sistêmica, enquanto aqueles injetados 256-512 estágio de célula mantida carga bacteriana na gema. B) Embriões injetados entre 16-64 estágio de célula com M cepa mostrou formação de granuloma como estruturas e infecção sistêmica, enquanto aqueles injetado 128-512 estágio de célula mantida carga bacteriana na gema . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" fo: Conteúdo-width = "5 polegadas" fo: src = "/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg" /> Figura 5. Tratamento de M. infecção aguda marinum com uma primeira linha anti-tuberculose de drogas. Embriões injetados entre 16-64 estágio de célula com 30 ufc de M. marinum M tensão foram executados através da partícula grande citômetro de fluxo em 3 dpi a ser classificado em dois grupos após descartar os embriões não e / ou altamente infectadas. A) fluorescência de embriões individuais em ambos os grupos. B) Os embriões tratados com rifampicina (RIF ) durante 48 horas, em doses de 12, 24, e 200 ^ M foram analisados ​​em 4 dpi; a carga bacteriana é significativamente reduzida. C) Perfis COPAS representativos de embriões tratados com DMSO e rifampicina em doses de 12, 24, e 200 uM, durante 24 horas. Carga e distribuição de bactérias é indicada pelos picos vermelho. Linha azul representa o perfil do elemento classificado (4 dpf zebrafish embryo) pelos COPAS. Foram analisadas 60-90 embriões por condição. Cada ponto de dados representa um embrião individual. Os valores são indicados como média ± SEM. ns: diferenças não significativas. Análise de significância estatística das diferenças foi realizada por ANOVA seguido pelo teste de Tukey posthoc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6. Tratamento de M. infecção crônica marinum com uma primeira linha de drogas antituberculose. Embriões injetados entre 16-64 estágio de célula com 30 ufc de M. marinum E11 tensão foram executados através do grande fluxo de partículas citômetro de 3 dpi a ser classificado em dois grupos após descartar os embriões não e / ou altamente infectadas. A) A fluorescência de embriões individuais, em ambos os grupos. B) Os embriões tratados com rifampicina (RIF) a 200 uM durante 4 dias foram analisadas, mostrando uma redução significativa da carga bacteriana após 1 dia de tratamento. Foram analisados ​​90 embriões por condição. Os valores são indicados como média ± SEM. Letras diferentes indicam diferenças significativas entre pontos de tempo do mesmo tratamento. * Indica diferenças significativas com o grupo controle. ns: diferenças não significativas. Análise de significância estatística das diferenças foi realizada por ANOVA seguido por teste post hoc de Tukey. (P <0,05). Figura B) tenha sido modificado a partir Spaink et al. (2013) 13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/> Figura 7. Resultado de M. marinum E11 injeção gema fotografada usando Tecnologia de Triagem de Vertebrados automatizada e CLSM. pilha Z confocal (costurado 3 imagens) de um 5 dpi FLI1-egfp 14 embrião. A) embrião vivo mostrando proliferação de M. bactérias marinum E11 (vermelho) em todo o corpo. B) Fixa 5 dpi fli-egfp embrião mostrando M. bactérias marinum E11 (vermelho) em todo o corpo co-localização com leucócitos (azul claro) detectada pelo L-plastin imunomarcação 15.