إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em> المكورات العنقودية البشروية</em> و<em> المتفطرة البحرية</em> عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات
Summary
توضح هذه المقالة الفيديو خط أنابيب الإنتاجية العالية التي أنشئت بنجاح لتصيب وتحليل أعداد كبيرة من الأجنة الزرد توفير أداة قوية جديدة لاختبار المركب واكتشاف المخدرات باستخدام كله كائن فقاري الحيوان.
Abstract
الزرد أصبحت أداة قيمة في المرحلة قبل السريرية من العروض اكتشاف المخدرات كنموذج الحيوان كله مع إنتاجية عالية الاحتمالات الفرز. أنها يمكن أن تستخدم لردم الهوة بين المقايسات الخلية التي يوجد مقرها في المراحل السابقة والتحقق من صحة في الجسم الحي في نماذج الثدييات، والحد، وبهذه الطريقة، فإن عدد المركبات التي تمر عبر لإجراء تجارب على نماذج القوارض أكثر تكلفة بكثير. في ضوء ذلك، في مخطوطة موجودة يوصف خط أنابيب إنتاجية عالية جديدة باستخدام الزرد كما هو الحال في الجسم الحي نظام نموذجي لدراسة المكورات العنقودية البشروية والعدوى marinum المتفطرة. هذا الإعداد يسمح توليد وتحليل عدد كبير من الأجنة المصابة متزامن متجانس. وعلاوة على ذلك المرونة في خط أنابيب يسمح للمستخدم لتنفيذ بسهولة منصات أخرى لتحسين القرار من تحليل عند الحاجة. مزيج من الزرد جنبا إلى جنب مع الشركة المصرية للاتصالات مبتكرة إنتاجية عاليةchnologies يفتح مجال اختبار المخدرات واكتشاف إمكانيات جديدة ليست فقط بسبب قوة باستخدام نموذج الحيوان كله ولكن أيضا بسبب وجود عدد كبير من خطوط المعدلة وراثيا المتاحة التي يمكن استخدامها لفك طريقة عمل مركبات جديدة.
Introduction
حتى الآن الزرد (دانيو rerio) وقد أنشئت بنجاح كنموذج فعال لدراسة مجموعة متنوعة من الأمراض المعدية 1. الجنين الزرد يوفر إمكانيات فريدة من نوعها في الجسم الحي التصوير بسبب شفافيتها وعدد كبير من خطوط مراسل المعدلة وراثيا الموجودة معربا عن البروتينات الفلورية. هذه تركيبة قوية يجعل من الممكن لتتبع مختلف أنواع الخلايا المناعية في الوقت المناسب أثناء التفاعل مع مسببات الأمراض مثل المتفطرة البحرية، وأقرب قريب من M. 2 السل، أو المكورات العنقودية البشروية، والمسبب الرئيسي لمادة بيولوجية العدوى المرتبطة 3-5. طرق مختلفة من العدوى يمكن أن تستخدم في الأجنة الزرد تبعا لأغراض الدراسة 6.
واحد من هذه المسارات العدوى حقن صفار من البكتيريا. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة بالمقارنة مع الآخرين هو أن infecti صفارلا يمكن أن يؤديها على تلقائيا عن طريق الحقن الروبوتية، والحد بشكل كبير من الوقت والسماح حقن استنساخ عالية من العدوى 7، 8.
العمل السابق، وذلك باستخدام الزرد باعتباره إنتاجية عالية في النظام النموذجي الجسم الحي لدراسة S. البشروية وM. أظهرت العدوى marinum أن تكون ناجحة 7، 8. هذا النظام قادر على كشف عن تطور المرض عن طريق الحقن الروبوتية صفار الأجنة المبكر وباستخدام مضان قراءات كإجراء لالحمولة الجرثومية. في اتفاق مع هذه الفكرة، وقد تم تحسين هذا الإعداد وإنشاء خط أنابيب إنتاجية عالية ذات كفاءة عالية مع القدرة على توليد عدد كبير من الأجنة المصابة متجانس وتتبع تطور العدوى خلال فترة بعد العلاج مع عدد من المركبات. مع الإعداد أنشئت فمن الممكن أن تولد ما يصل إلى 8،000 الأجنة متزامن إلى الشاشةلتطور المرض، وتجهيز بهذه الطريقة تصل إلى 2،500 الأجنة في الساعة. يتم فرز الأجنة على أساس حمولتها البكتيرية باستخدام نظام آلي، وضمان مجموعات متجانسة من اليرقات المصابة. علاوة على ذلك، للتحقق من صحة الإعداد، قد تم اختبارها آثار إشارة معروفة لمنع تطور مرض السل في الثدييات على أجنة مصابة M. marinum E11 سلالة أو أكثر ضراوة السلالة M 9.
توضح هذه الدراسة بالتفصيل خط أنابيب إنتاجية عالية التي أنشئت لتكون قادرة على توليد أعداد كبيرة من الأجنة المصابة وتحليلها لاحقا من تطور البكتيريا خلال التنمية وبعد العلاج المركب.
Protocol
Representative Results
Discussion
منهجية إنتاجية عالية وصفها في هذه الورقة يوفر خط أنابيب فعالة من حيث التكلفة وسريعة لفحص عدد كبير من الأجنة الأسماك واليرقات مع أنواع مختلفة من الالتهابات. باستخدام سفينة تربية كبيرة بدلا من الدبابات تربية واحدة أو الأسرة التقليدية سهلت السيطرة على عملية التبويض وتوليد عدد أكبر من البيض متزامن. مع نسخة محسنة من نظام حقن الصغرى الآلي 7، فمن الممكن لحقن ما يصل إلى 2،500 بيضة تقريبا كل خلية في المرحلة نفسها في حدود 1 ساعة. مع هذه التحديثات وتحسين البرمجيات فمن الممكن لحقن المزيد من البيض مما كان ممكنا في السابق والتي يمكن استخدامها لأداء شاشات كبيرة مع انتشار المخدرات البكتيرية باعتبارها تلا. ولكن هذه الطريقة لا تزال تقتصر على صفار الحقن، حقن الطرق الأخرى على سبيل المثال التي وصفها بينارد وآخرون. (2012) 6، ونأمل أن تدمج في نظام حقن الصغرى الآلي في المستقبل القريب.
<ع الطبقة = "jove_content"> على الرغم من أن تقاس هذه الطرق لفحص الزرد، فإنه سيكون من المفيد للتطبيقات مع أنواع الأسماك الأخرى كذلك. على سبيل المثال، قد أشار الكارب الشائع لديها مزايا للشاشات المخدرات. مثل الزرد والبيض والأجنة في مرحلة مبكرة من الكارب الشائع وشفافية، ولكن مع الميزة الرئيسية لحجمها تفرخ كبيرة من مئات الآلاف من البيض وتوافر خطوط الفطرية التي تقدم خلفية وراثية أكثر ثباتا 16.ويتم تحليل كميات كبيرة من الأجنة المصابة مع إنتاجية عالية كبيرة تدفق الجسيمات عداد الكريات. هذا الجهاز يمكن تحليلها نوع الأجنة في لوحات متعددة جيدا أو طبق بتري مما يجعلها مناسبة خاصة لاختبار أعداد كبيرة من المركبات. إذا كان هناك حاجة لقرار التصوير العالي، ويتم تكييف من الإعداد بطريقة تدفق الجسيمات الكبيرة عداد الكريات التكنولوجيا يمكن استخدامها للفحص المسبق، وبعد ذلك تحليل العينات في المتوسط خلالوضعت بدقة أعلى. ويمكن أن يتم ذلك باستخدام تقنية فحص الفقارية الآلي 17، 18. هذا الجهاز يمكن أن تجمع تلقائيا الأجنة الحية أو الثابتة بين الإخصاب 2 و 7 أيام آخر من لوحة متعددة جيدا أو حاوية السوائب، الصورة 360 درجة من خلال الشعيرات الدموية باستخدام CLSM أو المجهر ستيريو والتصرف مرة أخرى في 2 حاويات السوائب السماح الفرز اليدوي للأجنة يستند على الصور المجهرية. وإدخال تحسينات في المستقبل تسمح للفرز الجنين بعد التصوير في لوحة جيدا متعددة، مما يجعل من الممكن لفحص عدد كبير من الأجنة الفردية تلقائيا بمرور الوقت مع CLSM. على افتراض أن يمكن أيضا أن تكون متصلا نظام تكنولوجيا فحص الفقارية الآلي في التطبيقات المستقبلية لتدفق الجسيمات الكبيرة عداد الكريات التكنولوجيا دون الحاجة اليرقات قبل صرفها في لوحات متعددة جيدا، وسوف يؤدي إلى فرز أكثر تقدما.
وتصف هذه الورقة مؤسسةد الأمثل من الإعداد إنتاجية عالية لدراسة S. البشروية وM. عدوى marinum كنموذج لاكتشاف المخدرات. فإنه يدل على أن نتائج هذه البكتيريا تحقن في صفار يعتمد على مرحلة تنموية من البيض في وقت الحقن. عن طريق الحقن M. marinum E11 في المرحلة 16-128 خلية أو سلالة M 16-64 في مرحلة الخلية يؤدي إلى نمط العدوى نفس المنوال الذيلية حقن 2، 6. ولكن هذا الإعداد لا يقتصر على انتشار مسببات الأمراض البكتيرية فقط. وقد تبين ذلك من قبل أنه من الممكن لحقن آليا المحاليل المحتوية على الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي أو morpholinos لنقل الجينات، والإفراط في التعبير الجيني وتدق إلى أسفل الدراسات، على التوالي 13. علاوة على ذلك، فقد تبين أن هذا الإعداد مفيد أيضا لدراسة انتشار الخلايا السرطانية والهجرة. لذا يقدم هذا الخط وسيلة تنوعا للشاشات إنتاجية عالية من مجموعة متنوعة من آليات إشارة في سياقالحصانة الفطرية، وتطبيقها على الأمراض المعدية وتطور السرطان. هذه الشاشات يمكن الجمع مع الآخرين لاكتشاف الدواء ولكن أيضا مع تحليل الآثار السامة المحتملة من الأدوية المطبقة التي تم تحديدها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون ليوني دي بوير وباس زات (المركز الأكاديمي الطبي) لتزويدنا S. البشروية O-47 سلالة. نشكر ريكو بونجارتس، فرانسيس سميت وأنجيلا كوماس (الاتحاد Biometrica) طلبا للمساعدة والمشورة مع COPAS XL وتحليل BioImager الشاسعة. نشكر ديفي دي ويت، أولريك Nehrdich، ولورا فان هولست للأسماك كالة الاشراف على العقار، وزملاء آخرين من جامعة ليدن لإجراء مناقشات مفيدة. يشكل هذا البحث جزء من مشروع P5.03 IBIZA من برنامج البحوث في المعهد المواد الطبية الحيوية، بتمويل مشترك من قبل وزارة الشؤون الاقتصادية الهولندية، وبرنامج ميكس الذكية (NWOA_6QY9BM) من وزارة الشؤون الاقتصادية الهولندية و وزارة هولندا التعليم والثقافة والعلوم. تم الحصول على دعم إضافي من مشروع الاتحاد الأوروبي ZF-الصحية (FP7-الصحية 2009-242048)، وكان مدعوما من قبل RMJ ماري كوري الزمالة كما شهدت باحث في التدريب الأولي شبكة FishForPharma (PITN-GA-201 الاتحاد الأوروبي1-289209). تلقى SJR التمويل من الأدوية المبتكرة المبادرة المشتركة التعهد بموجب اتفاق منحة رقم 115337، والموارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) والشركات EFPIA في الكتاب contribution.The نوع تقر الدعم المالي من صندوق جامعة ليدن (LUF) لالروبوتات ومن Cyttron، في برنامج الإعانات Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit، والذي بدوره يدعم ماليا من قبل المنظمة الهولندية للأبحاث العلمية لمرافق التصوير. وأيد اقتناء نظام COPAS جزئيا من قبل شعبة علوم الأرض والحياة (ALW) مع مساعدات مالية من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO، 834.10.004).
Materials
| Middlebrook 7H10 agar | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 271310 | |
| BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211886 | |
| BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211887 | |
| LB agar | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L5542 | Multiple suppliers |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L3022 | Multiple suppliers |
| Chloramphenicol | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 16785.03 | Multiple suppliers |
| Hygromycin | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 25966.01 | Multiple suppliers |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | P1754 | Multiple suppliers |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Calbiochem, San Diego, California, USA | 529504 | Multiple suppliers |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | A5040 | |
| Agarose | Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands | S103 | Multiple suppliers |
| Instant ocean sea salt | Sera Marin, Heinsberg, Germany | 5460 | |
| iSPAWN | Techniplast, Buguggiate, Italy | iSPAWN | |
| Automated microinjection system | Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands | Automated microinjection system | |
| Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | COPAS XL | |
| Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | VAST BioImager | |
| LP Sampler | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | LP Sampler | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SL | |
| Injection needle 10 µm inner diameter | Qvotek, Mississauga, Canada |
References
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. , (2012).
- Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
- Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
- Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
- Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
- Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
- Chang, T. -. Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).
