A Step Beyond BRET: Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL)

Transferência de Energia de Ressonância (RET), é uma interacção não-radiativos entre um doador e um aceitador luminescente fluorescente, pelo que a energia a partir do dador saiu é capaz de induzir uma resposta de fluorescência a partir do receptor por meio de uma interacção dipolo-dipolo forte 13. RET, o que tem sido descrito usando 23 fluorescente, quimioluminescente 24, e bioluminescentes 13 doadores, requer principalmente: uma sobreposição espectral entre a emissão forte dador e aceitador de espectros de excitação;. 2 alinhamento rotacional adequado entre as duas entidades.; e 3. uma distância de trabalho não seja superior a 0,5 a 2 vezes o raio de Förster, R 0, entre o doador e receptor 17. Contrastando com RET, COMBUSTÍVEL ocorre quando uma fonte luminescente, tal como uma bactéria bioluminescentes, emite um fotão que é absorvida e re-emitida por uma segunda entidade, tal como um fluoróforo ou uma nanopartícula fluorescente, vermelho-deslocando o SPECT de emissãorum da fonte luminescente originais. Assim, COMBUSTÍVEL segue um processo de emissão de excitação semelhante ao padrão de epifluorescência condições normais, no entanto, sem o uso de um concentrado de excitação. Prova disso pode ser facilmente observado pela simples mistura de bactérias luminescentes e altamente fluorescentes pontos quânticos. Na presença do Vibrio sp, um aumento significativo no sinal vermelho é observado quando QD705 também estavam em solução em comparação com um controlo não-fluorescente microesfera de poliestireno (Figura 1A). Os componentes necessários para criar a bioluminescência, essencialmente, do substrato de aldeído, a luciferase, e ATP, são produzidos e contido no interior do citoplasma. Além disso, a produção enzimática luminóforo ocorre dentro do citoplasma bacteriano (Figura 1B). Como foi relatado noutro local, a distância entre a membrana interna e externa da bactéria é tipicamente maior do que 30 nm, 25-27, a uma distância que não permite a RET significativade ocorrer. Além disso, as nanopartículas fluorescentes não atravessam para o citoplasma bacteriano uma vez que não existe a endocitose ou outros meios de absorção. Juntas, essas restrições indicam que o combustível é o fenômeno de emissão de excitação dominante que ocorre quando bactérias luminescentes são misturadas com nanopartículas fluorescentes. Como foi mostrado anteriormente, FUEL existe além da gama de RET. Para investigar a dependência de combustíveis em distância, de volume reduzido cuvetes espectrofotométricos padrão pode ser usado, com uma solução que contém um fluoróforo, um segundo contendo um controle adequado que pode controlar a dispersão, e a terceira contém uma alíquota de solução luminescente fresco. É essencial que o centro da cuvete ser envolto com fita preta ou outro material opaco, com excepção de, pelo menos, duas janelas ópticas idênticas localizadas em faces opostas, para reduzir qualquer potencial contaminação de luz a partir da fonte luminescente. Além disso, as duas cuvetes restantes precisaser colocadas de forma equidistante em ambos os lados do centro da cuvete. Finalmente, uma solução luminescente fresco, por meio de bactérias ou de quimioluminescência, deve ser utilizada com cada experiência para assegurar uma produção máxima de luz. Após a colocação apropriada, adquirir o sinal de luminescência sob os filtros desejados. A luz total e 710-730 nm filtros foram utilizados neste caso, apesar de apenas os dados a partir do último é mostrado. Depois de cada uma das aquisições, aumentar de forma incremental a distância face-a-face entre 1,0 cm e 3 cm (Figura 2). Finalmente, normalizar todos os dados para o ponto mais brilhante. Nos exemplos utilizados aqui, isto ocorreu a uma distância mais curta (D = 1 cm) entre a fonte luminescente e a cuvete contendo o QD705. Utilizando esta abordagem, o sinal COMBUSTÍVEL viável pode ser observado até a aquisição definitiva sugerindo que, na ausência de qualquer absorvedor óptico, o combustível pode ocorrer a distâncias superiores a qualquer eventual transferência de energia de ressonância e só pode ser explicada a ser puramente radiativoefeito. Ajustando os dados revelam uma diminuição do sinal como uma função da distância D na sequência de uma D-1 para a dependência D -2. Dependendo da configuração geométrica, a primeira corresponde à dependência distância capacitor eo segundo a lei do inverso do quadrado para fontes pontuais. Este resultado é, portanto, consistente com a configuração geral de aquisição, dado o tamanho da abertura da cuvete e a distância entre a fonte luminescente e o fluoróforo. O combustível não se aplica somente a quantum dots, mas também pode ser observada por meio de uma ampla variedade de fluoróforos que variam a partir da série de microesferas fluorescentes Alexa (Tabela 2). A fim de ser comparável à de controlo, as concentrações iguais dos vários fluoróforos deve ser usada e a área total da superfície das nanopartículas mantido constante (Tabela 1). Ao comparar os fluoróforos e nanopartículas para seus controles apropriados (PS ou PS com não-fluorescentemicroesferas de poliestireno), um aumento significativo no sinal é observada no máximo de emissão de cada entidade fluorescente. Foi encontrado o maior aumento relativo do sinal de ocorrer onde o máximo de emissão de fluorescência foi mais distante a partir do máximo de emissão luminescente. Isto é o mais provável devido ao aumento da especificidade do sinal de fluorescência em comparação com o largo espectro de emissão da fonte luminescente. Pelo contrário, o sinal COMBUSTÍVEL menos fiável foi encontrado quando os dois máximos de emissão não foram bem separados. Curiosamente, um sinal COMBUSTÍVEL discernível foi encontrada com as microesferas amarelas, embora a diferença espectral é mínimo, provavelmente devido à quantidade substancial do fluoróforo presente por pérola (350 equivalentes de fluoresceína). Os resultados aqui apresentados indicam que sob condições apropriadas de combustível pode ser alcançada com uma variedade de fluoróforos, que permite a confecção de sondas escolhidas para aplicações mais pertinentes no âmbito tanto in vitro e em condições in vivo. O significado do sinal COMBUSTÍVEL observada foi determinada usando um teste t de Student bicaudal padrão. Como tal, apenas o Alexa555 foi considerado incompatível com a fonte luminescente usado. A fim de explorar os efeitos da segmentação em FUEL, anticorpos biotinilados foram usados ​​para direcionar as bactérias luminescentes e QDs ligadas a estreptavidina. É importante que as bactérias ou fonte luminescência fornecer uma camada de espessura suficiente para minimizar a possibilidade de RET entre o luminófero e o fluoróforo correspondente. Após incubação e lavagem para remover os anticorpos não ligados, as bactérias marcadas com biotina são então expostas quer QD705 estreptavidina conjugada ou QD705 não-funcionalizada como o controlo, as soluções divididas e um conjunto expostos a lavagens adicionais a fim de remover qualquer não-aderente QD705. Aqui, para todas as quatro condições, a luminescência resultante foi observada sob a luz total, 490-510 nm, umad 710-730 nm filtros, embora apenas os dois últimos filtros são utilizados para a análise de dados. A presença do QD705 foi comparada através 450-480 nm de excitação e 710-730 nm filtros de emissão. Após investigação encontramos pouca ou nenhuma diferença no sinal vermelho deslocado quando as soluções foram deixadas em um estado sujo (Figura 3). O sinal de fluorescência resultante sob esta condição também é encontrado para ser muito semelhante, sugerindo que um número igual de QD705 estava presente tanto no âmbito do Estado-alvo e não-alvo. No entanto, a lavagem das amostras para remover qualquer QD705 solto proporciona um aumento de quase duas vezes na sinal vermelho em relação às bactérias alvo em relação ao seu controle não-alvo. Investigação de fluorescência pode ser utilizado para verificar a presença ou ausência do QD705. Comparativamente, a condição lavado alvo resultou em uma intensidade de fluorescência que foi quase três vezes menos do que a condição de sujo, mas o desvio para o vermelho resultante diminuiu apenas30%, sugerindo que sob as condições puramente ligados a segmentação das bactérias irá resultar num aumento da emissão vermelho deslocado. Isso implica fortemente a utilidade de FUEL direcionados para aplicações futuras. Figura 1. UM COMBUSTÍVEL interacção entre as bactérias luminescentes e disponíveis comercialmente quantum dots leva a um aumento na produção de fotões vermelhos. Duas cuvetes espectrofotométricos foram cheias com soluções contendo 100 mL alíquotas de fresco V. fischeri cultura com uma DO600 de 1-1,5, 895 ul de PS, e quer 5 ul de QD705 ou solução salina fisiológica (PS), antes de serem colocadas num espectro IVIS e o espectro de emissão adquirida. Um aumento significativo no sinal vermelho é alcançada devido à presença deo QD705, como pode ser observado pelo aumento fótons detectados • sec -1 • cm -2 (p • s -1 • cm -2) em relação ao controle sob o filtro de emissão de 710-730 nm (A). Aqui, a dupla membrana das bactérias exclui a interacção das porções luminescentes (círculos azuis) e a QD705 (círculos pretos). O ex-são encontradas apenas no citoplasma bacteriano enquanto o último são distribuídos gratuitamente na solução de massa (B). N = 3 para cada solução bacteriana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Evidência de FUEL ocorrendo em distâncias complexcluindo etely transferência de energia de ressonância. cuvetes espectrofotométricos foram preenchidas com soluções contendo quer 50 ul de QD705 e 950 ul de solução salina fisiológica (PS) ou de 97,2 ul de microesferas não fluorescentes 48 nm de poliestireno e 902,8 mL de PS, e colocada de modo equidistante, em lados opostos de uma cuvete negro central contendo 1 ml de fresco luminescente Photobacterium sp a um OD 600 de 1-1,5. A cuvete central de duas janelas ópticas idênticas, permitindo os fotões emitidos para dispersar livremente. Obtenção de imagens a distâncias (D) variando de 1,0 a 3 cm, a produção observada de luz vermelha diminuiu em função da distância que demonstre que o combustível pode ocorrer a distâncias não realizáveis ​​por transferência de energia de ressonância. A intensidade parecia ter D -2 dependência, semelhante à lei do inverso do quadrado (esquerda). O mesmo protocolo foi seguido por E. coli (direita). As linhas de tendência resultantes segurar forma ao conceito that as bactérias estão atuando como fontes pontuais de luz. Um total de três medições independentes distância foram adquiridos com cada usando uma subcultura única. As barras de erro estão presentes em cada ponto. Em alguns casos, as barras de erro foram menores do que os símbolos usados ​​que indicam a intensidade normalizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. Uma comparação entre alvo (específico) e não-alvo (solução a granel) de combustível. K. pneumoniae foram funcionalizados com anticorpos biotinilados e, em seguida, expostos a um ou outro marcado com estreptavidina (Targeted) ou não-marcado (não-alvo) QD705. As soluções resultantes foram igualmente divided e um conjunto lavadas três vezes com PBS antes de serem ressuspensas no seu volume inicial em PBS. As soluções foram então distribuídas em poços individuais de uma placa preta de 96 poços e a bioluminescência observada sob os 490-510 nm (500 nm) e de 710-730 nm (720 nm), filtros de emissão (indicados como barras azuis). A p • • seg -1 cm -2 encontrado a partir do filtro de 720 nm para cada poço foi normalizado pela respectiva p • • seg -1 cm -2 intensidade bioluminescência do 500 nm do mesmo poço. A intensidade relativa de fluorescência resultante a partir de uma excitação de epifluorescência foi determinada usando 450-480 nm de excitação e de emissão de filtros 710-730 nm (indicado como barras vermelhas). Pouca ou nenhuma diferença no sinal bioluminescente ou fluorescente foi observada nas condições sujas (não-alvo Unwashed e alvejados Unwashed). Isto sugere que o limite e de livre flutuação QD705 foram igualmente animado com os fótons bioluminescentes. Após a lavagem, ninício de uma diferença de duas vezes no sinal vermelho em relação foi observada para as bactérias QD705-marcados (Targeted lavado) em comparação com o controle (não-alvejado lavado). A ausência de QD705 na não-alvejado Lavado foi confirmado pela falta de sinal fluorescente e verificou-se a rotulagem QD705 no estado Washed alvejado. Os dados são de quatro culturas independentes de K. pneumoniae. Para maior clareza, a legenda indica a fonte da excitação QD705. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Fluoróforo Concentração mL PS (ul) λ max ex / em (nm) Filtro Emission (n m) Alexa 555 37,2 mM 4,77 995,23 555/565 570-590 Alexa 568 37,2 mM 4,77 995,23 578/603 590-610 Alexa 633 37,2 mM 4,77 995,23 632/637 650-670 width: 108px; "> Alexa 700 37,2 mM 4,77 995,23 702/723 710-730 Não fluorescente 2,62% de sólidos 9.72 990,28 μSph Rosa 5% de sólidos 4,77 995,23 580/605 610-630 μSph Amarelo 5% de sólidos 4,77 995,23 505/515 510-530 QD705 2 uM 5 995 465/705 710-730 height: 22px; width: 108px; "> QD800 2 uM 5 995 465/705 790-810 Tabela 1. Propriedades de fluoróforos utilizados ao longo das manifestações de combustível. Controle filtro fluoróforo Controle valor de p p-sec -1 · cm -2 SD p-sec -1 · cm -2 SD A555 PS 580 1,08 x 10 7 3,31 x 10 6 9,09 x 10 6 1,75 x 10 6 0,233 A568 PS 600 8,47 x 10 6 4,23 x 10 6 4,49 x 10 6 9,71 x 10 5 0,094 A633 PS 660 2,40 x 10 6 1,25 x 10 6 7,85 x 10 5 2,39 x 10 5 0,046 A700 PS 720 5,53 x 10 5 2,46 x 10 5 1,54 x 10 5 <td> 6,05 x 10 4 0,026 MSPH Amarelo μspheres não fluorescentes 520 1,19 x 10 8 4,85 x 10 7 5,79 x 10 7 1,99 x 10 7 0,057 MSPH Rosa μspheres não fluorescentes 620 2,37 x 10 7 1,36 x 10 7 2,16 x 10 6 8,00 x 10 5 0,026 QD705 μspheres não fluorescentes 720 1,76 x 10 7 7,33 x 10 6 2,08 x 10 5 7,16 x 10 4 0,007 QD800 μspheres não fluorescentes 800 7,79 x 10 6 4,72 x 10 6 3,60 x 10 4 1,52 x 10 4 0.023 Tabela 2. Identificação de fluoróforos e nanopartículas fluorescentes compatíveis com combustível.