JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

שלב מעבר לברט: הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק)

Published: May 23, 2014
doi:
10.3791/51549
, , , , , , , , ,
1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole,Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology,Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot,Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786,Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire,Institut Pasteur

Summary

הרחבת הבסיס ותחולתה של הקרינה על ידי מאוגד עירור מהארה (דלק) על ידי מדידות העקרונות הרלוונטיים והוכחת התאימות שלה עם שפע של fluorophores ותנאים ממוקדי נוגדן.

Abstract

הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק) היא תהליך עירור פליטת קרינה שמייצר אות מוגברת ושיפור לעומת במבחנה in vivo. מניות דלק רבות של אותם העקרונות הבסיסיים כמו העברת פליטת אור התהודה אנרגיה (ברט), ובכל זאת שונה מאוד במרחקי עבודה המקובלים בין המקור זורח וישות הניאון. בעוד ברט מוגבל ביעילות עד למקסימום של 2 פעמים רדיוס פורסטר, בדרך כלל פחות מ 14 ננומטר, דלק יכול להתרחש במרחקים של עד מיקרומטר או אפילו סנטימטר בהעדר בולם אופטי. כאן אנו להרחיב על הבסיס ואת הישימות של דלק ידי עיון בעקרונות הרלוונטיים מאחורי התופעה ולהדגים את התאימות שלה עם מגוון רחב של fluorophores וחלקיקי ניאון. יתר על כן, השירות של דלק ממוקד נוגדן נחקר. דוגמאות שהובאו כאן מספקות ראיות לכך שדלק יכול להיות מנוצל עבור Applications בי ברט אינו אפשרי, למלא את החלל המרחבי הקיים בין ברט וההדמיה חיה כולה מסורתית.

Introduction

ההנדסה הגנטית של אורגניזמים, כגון וירוסי 1, 2, 3 חיידקים או יונקים קטנים 4 או כדי לגרום או פליטת אור constitutively מפורש, הייתה מוצלחת מאוד והוכיחה 5-7 באופן נרחב. פליטת אור, תגובת chemiluminescent in vivo מעורבת חומרים כימיים מתרחשים באופן טבעי, יש את היתרון של הפקת אור ללא הצורך במקור אור חיצוני. ככזה, ההדמיה bioluminescent אינה סובלת מהחסרונות הנפוצים של אות אוטומטית ואינו ספציפית מצאו מדימות פלואורסצנטי 8. כתוצאה מכך, יש פליטת אור יחס אות לרעש משמעותי שכן כל אות שאותרה מקורו אך ורק מהמקור המיועד. בעוד דגמים רבים ניצלו את אופרון לוקס מluminescens Photorhabdus (מקסימום פליטה מרוכז בין 480 ו490 ננומטר) במבחנה וביישומי vivo 9, השימוש בו בmamm הקטןals היה בעייתי בשל האופי מאוד של תנאי ההדמיה; קיומה המסעיר של בולמים אופטיים, כגון המוגלובין, וסוכני פיזור, כגון רקמות ועצמות, חזק להשפיע כחול לאורכי גל צהובים 3. הביטוי של לוציפראז מהונדס גחלילית (מקסימום פליטה ב 617nm) פותח לאחרונה ומשולב, מתן כלי שמאוד מתגבר על קליטה אופטית 10, אבל עדיין כפוף לפיזור אפקטים.

בתגובה, היו ניסיונות רבים לאדומים להעביר את האות הנפלטת לחלון האופטי הרצוי של 650-900 ננומטר, אזור של קליטה ופיזור ממוזערים, באמצעות העברת תהודה פליטת אור אנרגיה (ברט) 11-13. ככלי כדי לשפר את זיהוי אות, ברט, אשר משתמש במקור bioluminescent כתורם וfluorophore הוסיף כacceptor, מצא הצלחה מוגבלת. כדוגמא מכוננת של תופעה זו, "נקודות קוונטיות מאיר עצמית4; (SIQDs) 14 מורכבים שונה Renilla reniformis luciferases חייב שכבת פולימר-ליזין החיצוני נקודות קוונטיות של זמינה מסחרי (QDs). על מצע בנוסף, תגובת bioluminescent וכתוצאה גורמת פליטת הקרינה מQDs, שהניבו ייצור משמעותי של פוטונים אדומים. עם זאת, SIQDs אלה תחולה מוגבלת בהדמית vivo של אירועים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. תחולה מוגבלת זו היא ככל הנראה בשל הקושי של מקשר את הבדיקה הכפולה לאיבר, תא או הגן של עניין, שכן SIQDs לא ניתן מקודד גנטי ולכן ידרוש שינוי המשני של קליפת הפולימר. כדי לשפר את תחולתם, SIQDs החלופי, שבו luciferases מחויבים ישירות לליבה זורח, לאחרונה הועסק 15. בונה את של מושג SIQD, מערכת ברט ישימה יותר הושגה על ידי הצמדת לוציפראז Cypridina בdocyanine צבע 16, שהיה מסוגלת במיוחד מיקוד גידולים בעכברים תוך הפקת משמרת אדומה משמעותית מ460 ננומטר ל675 ננומטר. לעבור העברת אנרגיה לא מקרין, ברט עוקב אחר אותו אילוצים עיקריים כמו עמית הניאון שלה: שחייבת להיות חפיפה ספקטרלית חזקה בין הפליטה התורמת ואת ספקטרום עירור acceptor ומרחק העבודה בין שני moieties חייב להיות על סדר רדיוס פורסטר (5-14 ננומטר בהתאם לזוג-acceptor התורם, עם מרחק מקסימאלי יעיל של פעמיים רדיוס פורסטר 17). תלות מרחק זה מאוד מגבילה את סוגי אירועים שניתן לצפות באמצעות ברט כאמצעי כדי לשפר את זיהוי.

לאחרונה גישה חדשה זוהתה והפגינה מתחת הן במבחנה בתנאי vivo. בונה את הבסיס של ברט, הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק) 18, 19 </sup> גם דורש חפיפה ספקטרלית חזקה בין זורח ורכיבי ניאון. עם זאת, שלא כמו ברט, דלק הוא תהליך קרינה לחלוטין לפיה הפוטון הנפלט מהמקור זורח נספג על ידי fluorophore אופטי נגיש, אשר לאחר מכן פולט פוטון אדום העביר על פי תשואת קוונטי fluorophore. בדומה לברט, גישה זו יכולה לשמש גם כדי להתגבר על המגבלות של הדמיה בנוכחות בולמים אופטיים. המשמרת האדומה וכתוצאה מכך מספקת עלייה כללית וספציפיות באות זוהתה כתוצאה מירידה בהנחתה וצמצום השפעות פיזור אופטיות. דלק כבר דיווח להתרחש בין coli Escherichia bioluminescent להביע אופרון לוקס ו18 QDs, 19. בעוד בניסוי דומה לSIQDs, הבדל מהותי קיים: בדלק, זה לא הכרחי למקור זורח להיות כבול פיזי לfluorophore, המאפשר עבורr קידוד גנטי של החללית זורח. בשל זיהוי המוצלח של דלק בין חיידקים זורח וQDs, זה אפשרי, כי טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על שני שטחי (עור) ורקמות עמוקות (ריאות, כבד) זיהומים כגון סטפילוקוקוס וKlebsiellia דלקת ריאות.

מאז הדו"ח של המשמעות הניסיונית שלה, דלק התפתח לכלול מודל מתמטי חזק 20 שיכולים לשמש כדי לחזות זורח מקובלות וזוגות ניאון, והיישומים שלה יורחבו ויכללו שימוש בזיהוי מאפייני photophysical כגון תשואת קוונטים. אנו מתארים להלן כמה מן הטכניקות הבסיסיות של דלק. ראשית, אנו מציגים ראיות לתופעה זו על שניהם קצר (מיקרומטר) וארוך (סנטימטר) מרחקים עובדים, אשר ביסוד מבדיל דלק מברט. שנית, אנו להרחיב על זוגות דלק האפשריים על ידי בחינת מגוון רחב של fluorophores וחלקיקי ניאון. Thirד, יישומי דלק נחקרים על ידי השוואת זוגות דלק ממוקד ולא ממוקדים.

Protocol

1. ריאגנטים רכישה או לפתח חיידקים זורח ותרבות תקשורת המתאימה כגון חיידקי Escherichia שונה המבטאים את ABCDE סוויטה דה לוקס 21, fischeri Vibrio, sp Photobacterium. Klebsiella pneumoniae 22. הכן תמיסת מלח פיסיולוגי (0.9% NaCl) ופתרונות תקשורת ותרבות על פי מתכונים סטנדרטיים. E. coli ו ק דלקת ריאות גדלו לוריא Bertani (LB) על 37 מעלות צלזיוס, וV. fischeri וsp Photobacterium בLB בתוספת 0.5 M NaCl על 22 ° C. רכישה או לרכוש בדיקות ניאון כגון Q-גשש 705 (40 קוטר ננומטר, המכונה QD705), 800 (בקוטר ננומטר 40, המכונה QD800) Q-גשש, ניאון (40 קוטר ננומטר) וזעירים מקלקר לא פלורסנט ( 48 קוטר ננומטר), וצבעי ניאון קונבנציונליים. הכן את חומרים כימיים הנחוצים לתיוג בקטריאלי. להבטיח גישה לתרמי פליטת אור חיה מלא, כמו ספקטרום IVIS, שמסוגל לזהות אות במגוון רחב של אורכי גל פליטה וזמני חשיפה. קורא צלחת מסוגל מדידות פליטת אור יספיק לרוב הניסויים שתוארו כאן. 2. שחזור בסיסי של דלק החל מ מושבות בודדות בתרבות צלחות סטנדרטיות, להתחיל תרבויות לילה של חיידקים זוהרים. הנה, V. fischeri היו בשימוש. היום של ניסויים, ליזום תת טריים ולאפשר להם להתקדם עד 600 OD של 1-1.5 מושגת. על מנת לייצר תוצאות דומות עדיף להשתמש בחיידקים במדינות צמיחה דומות שבהם מייצרים אותות אינטנסיביים. זה יכול להיות סמוך ובטוח על ידי שמירה מתמדת 600 OD. שלב aliquots של 100 μl מכל אחד עם או 5 μl של QD705 או תמיסת מלח פיסיולוגי (PS), ולאחר מכן להוסיף ל895 μl של PS לstandacuvettes ספקטרוסקופיות rd. הנח את cuvettes המלא לתוך ספקטרום IVIS ולקחת מדידות תחת מערכות הסינון המתאימות. הנה, היה בשימוש במסנן הפליטה 710-730 ננומטר. 3. דלק במהלך משתנים במרחקים מלא שני נפח מופחת (1 מיליליטר) cuvettes פוטומטריה פלסטיק עם או 50 μl של QD705 או 97.2 μl של זעירים מקלקר 48 ננומטר לא פלורסנט בנפח כולל של PS 1 מיליליטר. זה מבטיח שטח פנים מוצק דומה לנפח כולל בין שתי הישויות. הכן קובט מקור אור על ידי עוטף קובט שלישי עם סרט שחור סטנדרטי או חומר אטום אחר מסוגל לחסום אור. להכין שני חלונות אופטיים זהים בזהירות בצדדים מנוגדים של קובט. הנח את cuvettes מילא בעבר ישירות על גבי כל צד של קובט מקור האור. הוספת aliquot 1 מיליליטר של V. fischeri או אחרת תרבות (כלומר זורח E. coli או Photobacterium יםp) מתת טרי לתוך קובט מקור האור ולכסות אותו בחומר אטום, כגון נייר שחור כדי להפחית את כל זיהום אור. דמיין שלושה cuvettes תחת מסנני הפליטה המתאימים כגון האור סה"כ ו710-730 מסנני פליטת ננומטר, עם זמני חשיפה של 10, 30, ו30 שניות, בהתאמה. למקם את שני cuvettes החיצוני במרחקים נוספים שווי ערך מקובט המרכזי, ולאחר מכן לדמיין שוב. חזור על פעולה עד מרחק פנים אל פנים (מרכזיים לקובט נפח המופחת) סופי של 3 ס"מ מושגת. בכל שלב, לרכוש תמונת פלואורסצנטי (עירור 450-480 ננומטר, 710-730 פליטת ננומטר) כדי לאמת את מיקום QD705. 4. חקירת צמדי דלק פוטנציאליים מלא שני cuvettes נפח מופחת עם 1 פתרונות מיליליטר מכילים גם fluorophore או nanoparticle ניאון של עניין אחד, וPS או PS עם חלקיקים לא פלורסנט כביקורת השלילית באחר. העבודת הדואר הפגינה כאן, מגוון של fluorophores הפוטנציאל זמין מסחרי דלק וחלקיקי ניאון נחקר כפי שמתואר בטבלה 1. הוספת aliquot 1 מיליליטר של V. הטרי fischeri או חיידקים אחרים זורח לקובט השלישי מואפל המכיל שני חלונות אופטיים שווים מבחינה פיזית ממוקמים משני צדי מתרס. כסה קובט עם חומר אטום כגון פיסת נייר שחור. במקום מרחק קצר אבל שווה שני cuvettes הנפח המופחת בכל צד של קובט המואפל ולדמיין תחת המסננים המתאימים. כאן, מרחק של 0.7 סנטימטר היה בשימוש. חזור עם fluorophores האחר. 5. דלק ממוקד הכן נוגדני biotinylated ספציפיים לחיידקים זורח. לדוגמא, נוגדנים כאן ראשוניים ספציפי לק pneumoniae (α-KP) היו biotinylated באמצעות תמיסה המכילה EZ-Link sulfo-NHS-LC-ביוטין. </li> הסר מגיב עודף מהנוגדנים באמצעות עמודות desalting תחת צנטריפוגה (1,500 XG) במשך 2 דקות. השתמש assay ברדפורד סטנדרטי על מנת לקבוע את ריכוז החלבון ולקבוע את מידת biotinylation נוגדנים על ידי assay Haba. השג את נוגדן biotinylated α-KP-ביו קבוצות (AB) על ידי ערבוב 100 μl (10 מ"מ, מומס ב1x PBS) עם נוגדן α-Kp 40 μl, וכתוצאה מהתואר אחרון של החלפה של 16 שאריות ביוטין לAb וסופיים ריכוז חלבון של 10 -1 מיליליטר מ"ג. שימוש מרובה בלילה לשכפל תרבויות, למקד את החיידקים נשטפו עם הנוגדנים האמורים בעקבות הפרוטוקול המתאים. באופן ספציפי, לשטוף את ק pneumoniae ב 1x PBS, ו resuspend ב 1x PBS לOD של 4 (בערך 4 x 10 8 CFU מיליליטר -1 OD -1). עבור כל לשכפל, דגירה 100 μl PBS, α -נוגדני KP (10 μl α-KP-biotB או 10 μl PBS לשליטה) ו100 תאי μl ל90 דקות ב30 ° C. לשטוף את התאים שלוש פעמים ב1x PBS, ו resuspend ב 196 μl PBS. לתייג את התאים עם הצמוד streptavidin QD705 ולחלק אותם לשני כרכים מקבילים. שטוף פתרון אחד שלוש פעמים ולאחר מכן resuspend אותו לנפח המתאים. הפץ של פתרונות שטף ולא רחוצים לתוך בארות בודדות של צלחת 96 היטב שחורה 100 μl. מדוד את הארה וכתוצאה תחת האור סה"כ, 490-510 ננומטר, ו710-730 מסננים ננומטר. ריכוז Fluorophore ניתן לקבוע באמצעות 450-480 עירור ננומטר ו710-730 פליטת ננומטר.

Representative Results

תהודה העברת אנרגיה (RET) היא אינטראקציה לא מקרינה בין תורם זורח וacceptor ניאון, לפיה האנרגיה מהתורם יצא היא מסוגלת גרימת תגובת הקרינה מacceptor דרך אינטראקציה דיפול דיפול חזקה 13. RET, אשר תואר באמצעות 23 ניאון, chemiluminescent 24, ו13 תורמים bioluminescent, בעיקר דורש: 1 חפיפה ספקטרלית חזקה בין פליטת התורם וספקטרום עירור accepter;. 2 יישור סיבוב מתאים בין שתי הישויות.; ו -3. מרחק עבודה שאינו עולה על 0.5-2-פעמים רדיוס פורסטר, R 0, בין התורם acceptor 17. הניגודיות עם RET, דלק מתרחש כאשר מקור זורח, כגון חיידקי bioluminescent, פולט פוטון שנספג מחדש נפלט על ידי גוף שני, כגון fluorophore או nanoparticle ניאון, SPECT הפליטה-shifting אדוםרום של המקור זורח המקורי. לפיכך, דלק כדלקמן תהליך עירור פליטה סטנדרטי דומה לתנאי epifluorescent סטנדרטיים, אך ללא שימוש בעירור ממוקד. עדות לכך ניתן לראות בקלות על ידי הערבוב הפשוט של חיידקים זורח ונקודות קוונטיות הפערים ניאון. בנוכחותם של sp Vibrio, גידול משמעותי באות אדומה נצפה כאשר QD705 גם היה בפתרון בהשוואה לשליטת microsphere הקלקר לא פלורסנט (איור 1 א). המרכיבים הדרושים כדי ליצור פליטת אור, למעשה מצע אלדהיד, לוציפראז, ו-ATP, כולם מיוצרים והכילו בתוך הציטופלסמה. יתר על כן, ייצור luminophore האנזימטית מתרחש בתוך הציטופלסמה החיידקים (איור 1). כפי שכבר דווח במקום אחר, המרחק בין הממברנה הפנימית וחיצונית של חיידקים הוא בדרך כלל יותר מ 30 25-27 ננומטר, מרחק שאינו מאפשר לRET המשמעותיכדי להתעורר. כמו כן, חלקיקי הניאון לא לחצות את גבול לתוך הציטופלסמה החיידקים שכן אין אנדוציטוזה או באמצעים אחרים של ספיגה. יחד, אילוצים אלה מצביעים על כך שהדלק הוא תופעת עירור הפליטה הדומיננטית המתרחשת כאשר חיידקים זורח מעורבבים עם חלקיקי ניאון. כפי שהראה בעבר, דלק קיים מעבר לטווח של RET. כדי לחקור את התלות בדלק על מרחק, יכול לשמש cuvettes spectrophotometric ירידה בנפח הסטנדרטי, עם אחד המכיל פתרון fluorophore, שני המכיל בקרה מתאימה שיכול לשלוט על פיזור, ושלישי המכיל aliquot של פתרון זורח טרי. זה חיוני כי קובט המרכזי להיות עטוף באמצעות קלטת שחורה או אחר חומר אטום, לשמור לפחות שני חלונות אופטיים זהים הממוקמים על פניהם הפוכים, כדי להפחית את זיהום כלשהו אור פוטנציאל מהמקור זורח. יתר על כן, שני cuvettes שנותר צריךלהיות ממוקם נפתח במרווחים שווים על שני צדדיו של קובט המרכזי. לבסוף, פתרון זורח טרי, תוך שימוש בחיידקים או chemiluminescence, יש להשתמש בכל ניסוי כדי להבטיח ייצור אור מרבי. על המיקום מתאים, לרכוש את אות הארה תחת המסננים הרצויים. האור סה"כ ו710-730 מסנני ננומטר שימשו במקרה זה, אם כי רק את הנתונים מזה האחרון מוצג. לאחר כל רכישה, להגדיל באופן הדרגתי את מרחק פנים אל פנים מ1.0 סנטימטר עד 3 סנטימטר (איור 2). לבסוף, לנרמל את כל הנתונים לנקודה הבהירה ביותר. בדוגמאות שמשמשות כאן, זה התרחש במרחק הקצר ביותר (סנטימטר D = 1) בין המקור זורח וקובט מכיל QD705. השימוש בגישה זו, אות דלק קיימא ניתן להבחין עד לרכישה הסופית המצביעה על כך, בהעדר כל בולם אופטי, דלק יכול להתרחש במרחקים מעבר לכל תהודה העברת אנרגיה אפשרית ויכולה להיות מוסברת רק כדי להיות טהור קרינהאפקט. התאמת הנתונים מגלה ירידה באות כפונקציה של מרחק D הבא D -1 תלות -2 D. בהתאם לתצורה הגיאומטרית, מקבילה לשעבר תלות מרחק הקבלים והאחרונה לחוק היפוך הריבוע למקורות נקודות. תוצאה זו היא אפוא בקנה אחד עם הגדרת הרכישה הכוללת שלנו, בהתחשב בגודלו של צמצם קובט והמרחק בין המקור זורח וfluorophore. דלק חל לא רק על נקודות קוונטיות, אלא גם ניתן לצפות באמצעות מגוון רחב של fluorophores החל מסדרת Alexa לזעירה מניאון (טבלה 2). כדי להיות דומה לשליטה, יש להשתמש בריכוזים שווים של fluorophores השונים ואת שטח הפנים הכולל של חלקיקים נשארים קבוע (טבלת 1). על ידי השוואת fluorophores וחלקיקים לשליטה והבקרה הנאותה שלהם (PS או PS עם לא פלורסנטזעירים מקלקר), גידול משמעותי באות הוא ציין במקסימום הפליטה של ​​כל ישות ניאון. העלייה היחסית הגדולה ביותר באות נמצאה להתרחש בו את מקסימום פליטת הניאון היה רחוק ממקסימום הפליטה זורח. זוהי ככל הנראה בשל סגוליות המוגברת של אות הניאון בהשוואה לספקטרום הפליטה הרחבה של המקור זורח. להיפך, את אות הדלק אמינה לפחות נמצא כאשר מקסימום שתי הפליטה לא הופרדו היטב. מעניין לציין, כי אות FUEL להבחין נמצאה עם זעירים מהצהוב למרות שהבדל הרפאים הוא מינימאלי, בשל הסיכוי הטוב ביותר לכמות משמעותית של fluorophore ההווה לחרוז (350 שווה והעמסת). התוצאות מוצגות כאן עולה כי בתנאים מתאימים דלק ניתן להשיג עם מגוון רחב של fluorophores, המאפשר התאמה של בדיקות שנבחרו ליישומים רלוונטיים יותר תחת שני iהמבחנה n ובתנאי vivo. המשמעות של אות הדלק נצפתה נקבעה באמצעות מבחן t של סטודנט שני זנב סטנדרטי. ככזה, רק Alexa555 נמצא להיות עולה בקנה אחד עם המקור זורח בשימוש. על מנת לחקור את ההשפעות של מיקוד על דלק, נוגדני biotinylated שימשו למקד חיידקים זורח וQDs צמוד streptavidin. חשוב שהחיידקים או מקור הארה לספק שכבה עבה מספיק כדי למזער את האפשרות של RET בין luminophore וfluorophore המקביל. לאחר דגירה ושטיפה כדי להסיר נוגדנים מאוגדים, החיידקים שכותרתו ביוטין לאחר מכן נחשפו לשני QD705 streptavidin מצומדות או QD705 שאינו פונקציונליות כמו השליטה, הפתרונות מחולקים וקבוצה אחת נחשפה לשטיפה נוספת על מנת להסיר כל שאינם דבקה QD705. כאן, לכל ארבעת תנאים, הארה וכתוצאה מכך נצפתה תחת האור סה"כ, 490-510 ננומטר,ד 710-730 מסננים ננומטר, אם כי רק שני המסננים האחרונים משמשים לניתוח נתונים. הנוכחות של QD705 הושוותה באמצעות 450-480 עירור ננומטר ו710-730 מסנני פליטת ננומטר. לאחר הבדיקה שמצאנו לא מעט הבדל באות אדום העביר כאשר הפתרונות נותרו במדינה רחוצה (איור 3). אות הקרינה וכתוצאה מכך במצב זה נמצא גם להיות די דומה, מה שמרמז כי מספר שווה של QD705 היה נוכח בשתי המדינה ממוקדת ולא ממוקד. עם זאת, שוטף את הדגימות כדי להסיר כל QD705 מאוגד מספק עלייה כמעט כפולה באות אדומה ביחס לחיידקים הממוקדים בהשוואה לשליטתם הלא הממוקד. חקירה על ידי הקרינה ניתן להשתמש כדי לאמת את קיומו או העדרו של QD705. יחסית, הממוקד המצב שטף הביא לעוצמת הקרינה שהייתה כמעט פי שלושה פחות מהמצב רחוץ, עדיין ההיסט לאדום וכתוצאה מכך נרשם ירידה של רק30%, דבר המצביע שבתנאים מחויבים אך ורק את המיקוד של החיידקים יגרום לעלייה בפליטת אדום העביר. זה מאוד מסבך את השירות של דלק מיועד ליישומים עתידיים. איור 1. אינטראקציה דלק בין חיידקים זורח ונקודות קוונטיות זמינות מסחרי מובילה לעלייה בייצור פוטון אדום. שני cuvettes spectrophotometric היו מלאים בפתרונות המכילים 100 aliquots μl של V. הטרי תרבות fischeri עם 600 OD של 1-1.5, 895 μl של PS, וגם μl 5 של QD705 או תמיסת מלח פיזיולוגית (PS), לפני שיוצב לספקטרום IVIS וספקטרום הפליטה הנרכש. גידול משמעותי באות אדומה מושגת בשל נוכחותם שלQD705, כפי שניתן לציין על ידי הגידול בפוטונים זוהו • שניות -1 • סנטימטר -2 (עמ '• שניות -1 • סנטימטר -2) לעומת השליטה מתחת למסנן הפליטה 710-730 ננומטר (א'). הנה, הקרום הכפול של החיידקים אינו כולל את האינטראקציה של moieties זורח (עיגולים כחולים) וQD705 (עיגולים שחורים). לשעבר נמצאים רק בציטופלסמה החיידקים בזמן האחרון מופצים בחופשיות בפתרון התפזורת (ב '). N = 3 עבור כל פתרון בקטריאלי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. ראיות של דלק המתרחש על פני מרחקי completely לא כולל העברת אנרגיית תהודה. cuvettes spectrophotometric היו מלאים בפתרונות המכילים גם 50 μl של QD705 ו950 μl של תמיסת מלח פיסיולוגי (PS) או 97.2 μl של זעירים מקלקר 48 ננומטר לא פלורסנט ו902.8 μl של PS, והניח במרווחים שווים משני צדים מתרס של קובט השחור מרכזי המכיל 1 מיליליטר של sp Photobacterium זורח הטרי ב600 OD של 1-1.5. היה לי קובט המרכזי שני חלונות אופטיים זהים המאפשרים פוטונים נפלטים לפזר בחופשיות. רכישת תמונות במרחקים (ד ') החל 1.0 סנטימטר עד 3 סנטימטר, הייצור נצפה של אור האדום ירד כפונקציה של מרחק בו מוצגות עדויות לכך שדלק יכול להתרחש במרחקים לא להשגה על ידי העברת אנרגיית תהודה. עוצמת נראית לי התלות -2 D, בדומה לחוק היפוך הריבוע (משמאל). אותו הפרוטוקול היה במעקב במשך E. coli (מימין). קווי מגמה וכתוצאה מכך לשמר את הצורה לtha המושגלא נמצאים החיידקים מתנהגים כמו מקורות אור. סכום כולל של שלוש מדידות מרחק עצמאיות נרכש עם כל שימוש בתת ייחודי. ברים שגיאה נמצאים בכל נקודה. בחלק ממקרי הברים השגיאה היו קטנים יותר מאשר הסמלים המשמשים המציינים את עוצמת המנורמלת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. השוואה בין ממוקד דלק (ספציפי) ולא ממוקד (פתרון בתפזורת). ק דלקת ריאות היו פונקציונליות עם נוגדני biotinylated ולאחר מכן נחשפו לשני QD705 כותרת streptavidin (ממוקדת) או שאינה מסומנת (הלא ממוקד). הפתרונות וכתוצאה מכך היו divi באותה מידהded וקבוצה אחת נשטפו שלוש פעמים עם PBS לפני שresuspended לתוך הנפח הראשוני שלה ב-PBS. הפתרונות היו לוותר אז לתוך בארות בודדות של צלחת 96, גם שחורה ופליטת האור נצפה תחת מסנני 490-510 ננומטר (500 ננומטר) ו710-730 ננומטר (ננומטר 720) פליטה (מסומן כסורגים כחולים). שניות • p -1 • סנטימטר -2 מצאו ממסנן 720 ננומטר לכל אחד גם היה מתוקנן לפי שניות • p בהתאמה -1 • סנטימטר -2 עוצמת פליטת אור מננומטר 500 מאותו היטב. עוצמת הקרינה היחסית כתוצאה מעירור epifluorescent נקבעה באמצעות 450-480 עירור ננומטר ו710-730 מסנני פליטת ננומטר (מסומן כקווים אדומים). לא מעט הבדל באות bioluminescent או ניאון נצפה תחת התנאים רחוצים (ללא ממוקד לא רחוץ ולא רחוצים ממוקד). הדבר מצביע על כך QD705 הכבול וחופשי צף היה מתרגש באותה מידה על ידי הפוטונים bioluminescent. על הכביסה, nמוקדם הבדל כפול באות אדומה יחסית נצפה עבור חיידקי שכותרת QD705 (ממוקדת שטף) בהשוואה לביקורת (הלא ממוקד שטף). היעדר QD705 ב- ממוקד ללא שטף אושר על ידי חוסר אות ניאון ואימת את תיוג QD705 בממוקד מדינת שטף. הנתונים הוא מארבע תרבויות עצמאיות של ק דלקת ריאות. לשם בהירות, האגדה מציינת את המקור של עירור QD705. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. Fluorophore התרכזות μl נ.ב. (μl) לשעבר מקסימום λ / em (ננומטר) מסנן פליטה (n מ ') אלקסה 555 37.2 מיקרומטר 4.77 995.23 555/565 570-590 אלקסה 568 37.2 מיקרומטר 4.77 995.23 578/603 590-610 אלקסה 633 37.2 מיקרומטר 4.77 995.23 632/637 650-670 רוחב: 108px; "> Alexa 700 37.2 מיקרומטר 4.77 995.23 702/723 710-730 Nonfluorescent מוצקי 2.62% 9.72 990.28 μSph פינק מוצקי 5% 4.77 995.23 580/605 610-630 μSph צהוב מוצקי 5% 4.77 995.23 505/515 510-530 QD705 2 מיקרומטר 5 995 465/705 710-730 גובה: 22px; רוחב: 108px; "> QD800 2 מיקרומטר 5 995 465/705 790-810 טבלת 1. מאפיינים של fluorophores בשימוש בכל הפגנות הדלק. בקרה מסנן fluorophore בקרה ערך p p · · שניות -1 סנטימטר -2 SD p · · שניות -1 סנטימטר -2 SD A555 נ.ב. 580 1.08 x 10 7 3.31 x 10 6 9.09 x 10 6 1.75 x 10 6 0.233 A568 נ.ב. 600 8.47 x 10 6 4.23 x 10 6 4.49 x 10 6 9.71 x 10 5 0.094 A633 נ.ב. 660 2.40 x 10 6 1.25 x 10 6 7.85 x 10 5 2.39 x 10 5 0.046 A700 נ.ב. 720 5.53 x 10 5 2.46 x 10 5 1.54 x 10 5 <td> 6.05 x 10 4 0.026 MSPH צהוב μspheres לא פלורסנט 520 1.19 x 10 8 4.85 x 10 7 5.79 x 10 7 1.99 x 10 7 0.057 MSPH פינק μspheres לא פלורסנט 620 2.37 x 10 7 1.36 x 10 7 2.16 x 10 6 8.00 x 10 5 0.026 QD705 μspheres לא פלורסנט 720 1.76 x 10 7 7.33 x 10 6 2.08 x 10 5 7.16 x 10 4 0.007 QD800 μspheres לא פלורסנט 800 7.79 x 10 6 4.72 x 10 6 3.60 x 10 4 1.52 x 10 4 0.023 טבלה 2. זיהוי של fluorophores וחלקיקי ניאון תואמים עם דלק.

Discussion

הפגנת היסוד של דלק יכולה להיות מושגת רק על ידי ערבוב של חיידקים זורח עם חלקיקים או QDs ניאון. שני הגופים יהיו מופרדים פיזי ולהישאר מעבר לכל מרחק RET יעיל. קשה יותר הוא אופטימיזציה של אות הדלק הן במבחנה in vivo. תחת תנאים במבחנה, עם או בלי הווה בולם אופטי, בדרך כלל התוספת של fluorophore העודף תהיה מספיק על מנת למקסם את תגובת הדלק. עם זאת, בתופעות ריכוזים גבוהים כגון מרווה סטטי או collisional יכול להוביל לאובדן של אות ניאון. ביצוע סדרת דילול על ידי באופן עצמאי שינוי הריכוז של המקור זורח וfluorophore יעזור לייעל את הריכוזים הרצויים. ההקמה ואופטימיזציה של דלק תחת בריכוזי vivo היא הרבה יותר קשה וצריכה להיות מטופל על בסיס מקרה לפי מקרה. זה יכול להיות קשה ליצור שיתוף ndition בי ישות הניאון ניתן לגשת אופטית על ידי המקור זורח. ככזה, החל בשיתוף זריקות ישירות של שני moieties יכול לספק מידע בנוגע להצלחה של דלק בתנאים אופטימליים.

פרוטוקולים סטנדרטיים קיימים לחיידקים תיוג ותאי אוקריוטים עם גופי ניאון כגון סדרת Alexa וQDs. לעתים קרובות זה דורש functionalization שטח או הפעלה עם נוגדנים, מה שעלול להוביל לתופעות לא רצויות כמו כדאיות תא מופחתות או פעילות המטבולית שונה. כדי להתגבר על זה, זה חשוב כדי לקבוע את הכמות האופטימלית של נוגדן או סוכן הפעלה דרושה שממזערת את הפרעות סלולריות תוך מיקסום ניאון התיוג. השימוש בQDs יש יתרון משום של הספקטרום הרחב שלהם אופייני עירור, ספקטרום פליטה צר ומתכונן, ואת האפשרות של שינוי סטוקס גדול. עם זאת, QDs יכול להיות ציטוטוקסיות ולא יכול להיות רצוי במקרים מסוימים.

<p class = "jove_content"> דלק הוא תופעה שקיימת בניסויי ברט רבים 13 וישימה למגוון רחב של זורח ומקורות ניאון. עד עכשיו, הפוטונים וכתוצאה מהדלק נחשבו התוצר של אינטראקציות שאינן ספציפיות או אות רקע מצערת כתוצאה מניסויי ברט לא תוכננו כראוי. זה רק עם הסוג של ניסויים הוכיחו כאן שאנחנו הצלחנו לזהות את התועלת של אותות לא רצויים זו. בדוגמאות שמוצגים, החיידקים זורח לפעול כמקור עירור מפוזר מסוגל לעורר תגובת ניאון סטנדרטית ממגוון רחב של גופי ניאון. כמו כן, בשל מרחק העבודה משמעותי, זה בטוח להגיע למסקנה שבזמן שהדלק יכול להיות שנבנה ללא ההתרחשות של ברט, ברט באופן כללי לא ניתן לצפות ללא תרומה מדלק. חשוב מכך, בשל חוסר דרישת מיקוד, דלק יכול לשמש כדי לכסות על הפער המרחבי הקיים בין ברט וגטכניקות הדמיה כל בעלי חי onventional.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להאריך את הכרת התודה שלהם לתמיכה כספית מקרן פסטר של ניו יורק (לJD, CS, CS), האיחוד האירופי-FP7 תכנית "האוטומציה" (לSLS), Institut התכנית קרנו 11 (לJD, AH , AR, RT, SLS) והפרויקט IMNOS (לRT, SLS), קרן קוני-מייב הצדקה (SLS), התואר השני באירופה בהדמיה מולקולרית (אליה), תוכניות האזור איל דה פראנס MODEXA (SLS), שומשום (SLS) וDimMalInf (SLS, RT), ANR תכנית Grandes Investissement de l'Avenir תשתיות Nationales en Biologie-סנטה: צרפת LifebioImaging (FLI) צרפת חיים הדמיה (RT, SLS), צרפת bioimaging (JD, SLS) ו מכון פסטר בפריז. יתר על כן, החוקרים רוצים להודות, José Bengoechea והרברט שוויצר לחומרים כימיים. יתר על כן, החוקרים רוצים להודות סינדי Fevre שנוצר הנוגדנים.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon  kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145  52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)  standard growth media
Q-Tracker 705  Life Sciences Q21061MP
Q-Tracker 800 Life Sciences Q21071MP
Alexa 555 Life Sciences S21381
Alexa 568 Life Sciences S11226
Alexa 633 Life Sciences S21375
Alexa 700 Life Sciences S21383
Non-fluorescent microspheres Polysciences, Inc 15913
Pink microspheres Life Sciences F8887 40nm diameter
yellow microspheres Life Sciences F8888 40nm diameter
Ivis Spectrum PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific Pierce 21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Scientific Pierce 21425
HABA assay kit  Thermo Scientific Pierce 28005
Bradford assay Bio-Rad 500-0201
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, K., et al. A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer. J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).
  2. Contag, C. H., et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
  3. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  4. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).
  5. Condeelis, J., Weissleder, R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).
  7. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. 10, (2010).
  8. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).
  9. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. Luminescent probes and visualization of bioluminescence. Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).
  10. Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light. Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).
  11. Saito, K., et al. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging. Nat Commun. 3, 1262 (2012).
  12. Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).
  13. Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. The BRET technology and its application to screening assays. Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).
  14. So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).
  15. Wu, Q., Chu, M. Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes. Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).
  16. Wu, C., et al. In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. -. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
  18. Dragavon, J., et al. in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. , 790210-790219 (2011).
  19. Dragavon, J., et al. In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).
  20. Holland, A. D., et al. In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer. Methods. , (2013).
  21. Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).
  22. Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect Immun. 31, 71-77 (1981).
  23. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging–techniques and applications. J Microsc. 247, 119-136 (2012).
  24. Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).
  25. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).
  26. Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles. Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).
  27. Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods. Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).

Tags

FUELFluorescenceLuminescenceBRETRadiative ExcitationEnergy TransferFluorophoresFluorescent NanoparticlesAntibody-targeted FUELIn VitroIn VivoWhole Animal Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dragavon, J., Sinow, C., Holland, A. D., Rekiki, A., Theodorou, I., Samson, C., Blazquez, S., Rogers, K. L., Tournebize, R., Shorte, S. L. A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL). J. Vis. Exp. (87), e51549, doi:10.3791/51549 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image