خطوة أبعد بريت: الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL)
Summary
توسيع المؤسسة وتطبيق الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL) من خلال المسح إلى المبادئ ذات الصلة ومما يدل على توافقه مع العديد من fluorophores وظروف استهداف الأجسام المضادة.
Abstract
مضان من قبل غير منضم الإثارة من التلألؤ (FUEL) هو عملية الإثارة الانبعاثات الإشعاعية التي تنتج زيادة إشارة وتعزيز التباين في التجارب المختبرية والحية. أسهم FUEL الكثير من نفس المبادئ الأساسية كما نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت)، ولكن يختلف كثيرا في العمل لمسافات مقبولة بين مصدر الانارة والكيان الفلورسنت. بينما بريت تقتصر على نحو فعال إلى حد أقصى قدره 2 مرات في دائرة نصف قطرها فورستر، عادة أقل من 14 نانومتر، ويمكن أن يحدث FUEL على مسافات تصل الى ميكرون أو حتى سم في حالة عدم وجود امتصاص البصرية. نحن هنا على اساس توسيع وتطبيق FUEL من خلال استعراض المبادئ ذات الصلة وراء هذه الظاهرة وإظهار توافقه مع مجموعة واسعة من fluorophores والنانوية الفلورسنت. أبعد من ذلك، هو استكشاف جدوى استهداف الأجسام المضادة FUEL. الأمثلة المعروضة هنا تقدم دليلا على أن وقود يمكن استخدامها لتطبيق ورقةications حيث بريت غير ممكن، وملء الفراغ المكاني القائم بين بريت والتصوير الحيوان كله التقليدية.
Introduction
التعديل الجيني للكائنات، مثل الفيروسات 1، 2، 3 البكتيريا، أو الثدييات الصغيرة 4 إلى إما لحث أو تلألؤ بيولوجي صريحة جوهري، كان ناجحا للغاية وأظهر على نطاق واسع 5-7. تلألؤ بيولوجي، رد فعل في الجسم الحي chemiluminescent تنطوي على الكواشف التي تحدث بشكل طبيعي، لديه ميزة إنتاج الضوء دون الحاجة إلى مصدر ضوء خارجي. على هذا النحو، لا تعاني التصوير إضاءة الحيوية من العيوب شيوعا من السيارات وغير محددة وجدت إشارة من مضان التصوير 8. بالتالي، تلألؤ بيولوجي لديها نسبة كبيرة إشارة إلى الضوضاء لأن أي إشارة الكشف عن تنبع فقط من مصدر المقصود. بينما العديد من النماذج استغلت الاوبرون لوكس من luminescens Photorhabdus (الحد الأقصى الانبعاثات تركزت بين 480 و 490 نانومتر) لفي المختبر والمجراة في التطبيقات 9، واستخدامه في مام الصغيرةوكان المرض إشكالية نظرا لطبيعة الظروف التصوير؛ وجود السائد من امتصاص البصرية، مثل الهيموجلوبين، وكلاء نثر، مثل الأنسجة والعظام، وتؤثر بقوة الأزرق لموجات الأصفر 3. تعبير عن يراعة luciferase هندسيا (الحد الأقصى للانبعاثات في 617nm) تم تطويره مؤخرا وأدرجت، وتوفير الأداة التي يتغلب بشكل كبير امتصاص البصرية 10، ولكن لا تزال تخضع لنثر الآثار.
ردا على ذلك، كانت هناك محاولات متعددة لتحويل الحمراء المنبعثة إشارة إلى إطار بصري المطلوب من 650-900 نانومتر، وهي منطقة من امتصاص التقليل والتشرذم، وذلك باستخدام الرنين تلألؤ بيولوجي نقل الطاقة (بريت) 11-13. كأداة لتعزيز الكشف عن إشارة، بريت، والذي يستخدم مصدرا للإضاءة الحيوية مثل المانحة وأضاف fluorophore كما متقبل، وقد وجدت نجاحا محدودا. كمثال المنوية من هذه الظاهرة "، أو النقاط الكم إلقاء الضوء على النفس4؛ (SIQDs) 14 تتكون من تعديل Renilla كلوية الشكل luciferases منضمة إلى طبقة البوليمر يسين الخارجية نقاط الكم المتاحة تجاريا (QDS). بالإضافة إلى ذلك على الركيزة، فإن رد الفعل للإضاءة الحيوية الناتجة يدفع الانبعاثات مضان من QDS، وتوليد إنتاج كبير من الفوتونات الحمراء. ومع ذلك، فإن هذه SIQDs تقتصر على تطبيق التصور في الجسم الحي من الأحداث ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ومن المرجح نظرا لصعوبة ربط التحقيق المزدوج إلى الجهاز، الخلية أو الجينات في المصالح، لأن SIQDs لا يمكن ترميز وراثيا وبالتالي يتطلب تعديل الثانوية للقذيفة البوليمر هذا محدودة التطبيق. لتحسين قابليتها للتطبيق، SIQDs البديلة، حيث لا بد من luciferases مباشرة إلى جوهر الانارة، وقد تم مؤخرا توظيف 15. بناء الخروج من مفهوم SIQD، تم التوصل إلى نظام بريت أكثر قابلية للتطبيق عن طريق ربط Cypridina luciferase المراسل إلى فيdocyanine صبغ 16، والتي كانت قادرة على استهداف تحديدا الاورام في الفئران بينما تنتج تحولا حمراء كبيرة من 460 نانومتر إلى 675 نانومتر. للخضوع لنقل الطاقة غير الإشعاعية، بريت يتبع نفس القيود الأولية مثل نظيرتها الفلورسنت: يجب أن يكون هناك تداخل الطيفية القوية بين الانبعاثات المانحة ومتقبل أطياف الإثارة والمسافة العمل بين الأنصاف اثنين يجب أن يكون بناء على أمر من فورستر دائرة نصف قطرها (5-14 نانومتر اعتمادا على الزوج المانحين متقبل، مع أقصى مسافة الفعال لضعف نصف قطر فورستر 17). هذا الاعتماد مسافة يحد كثيرا من أنواع الأحداث التي يمكن ملاحظتها باستخدام بريت كوسيلة لتعزيز الكشف.
مؤخرا تم تحديد نهج جديد وتظاهر تحت حد سواء في المختبر وفي ظروف الجسم الحي. بناء قبالة أساس بريت، الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL) 18، 19 </suع> أيضا يتطلب التداخل الطيفي قوية بين الانارة ومكونات الفلورسنت. ولكن، خلافا بريت، FUEL هو عملية الإشعاعي تماما حيث يتم امتصاص الفوتون المنبعث من مصدر الانارة من قبل fluorophore الوصول بصريا، والتي تنبعث بعد ذلك الفوتون الأحمر تحول وفقا لالكم العائد fluorophore. أقرب إلى بريت، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج من أجل التغلب على معوقات التصوير في وجود امتصاص البصرية. يوفر التحول الأحمر مما أدى إلى زيادة شاملة وخصوصية في إشارة الكشف يرجع ذلك إلى تراجع في تخفيف والحد من آثار تشتت بصري. وقد تم الإبلاغ عن وقود لتحدث بين القولونية إضاءة الحيوية معربا عن الاوبرون لوكس وQDS 18، 19. بينما مماثلة تجريبيا لSIQDs، والفرق الأساسي موجود: في FUEL، فإنه ليس من الضروري لمصدر الانارة ليكون جسديا منضمة إلى fluorophore، والذي يسمح للص الترميز الوراثي لجنة التحقيق الانارة. ويرجع ذلك إلى الكشف الناجح لFUEL بين البكتيريا الانارة وQDS، فمن الممكن أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على كلا سطحي (الجلد) والأنسجة العميقة (الرئة، الكبد) مثل التهابات المكورات العنقودية الذهبية وKlebsiellia الرئوية.
منذ تقرير أهميتها التجريبية، تطورت لتشمل FUEL نموذج رياضي قوي 20 التي يمكن استخدامها للتنبؤ الانارة مقبولة وأزواج الفلورسنت، وتوسعت لتشمل تطبيقاتها استخدامها في تحديد خصائص photophysical مثل العائد الكم. وصفنا أدناه بعض التقنيات الأساسية من الوقود. الأولى، وتبين لنا الدليل على هذه الظاهرة على حد سواء قصيرة (ميكرون) والطويلة (سم) المسافات العمل، والذي يميز جوهريا FUEL من بريت. الثانية، ونوسع على أزواج FUEL ممكن من خلال دراسة مجموعة واسعة من fluorophores والنانوية الفلورسنت. حجابهند، ويتم التحقيق تطبيقات FUEL بمقارنة أزواج FUEL المستهدفة وغير المستهدفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا يمكن أن يتحقق المظاهرة الأساسية للFUEL ببساطة عن طريق خلط البكتيريا مع الانارة الفلورسنت النانوية أو QDS. سيتم الكيانين المنفصلين جسديا وتظل أبعد من أي مسافة RET كفاءة. أكثر صعوبة هو الوقود إشارة الأمثل سواء في التجارب المختبرية والحية. تحت ظروف في المختبر، مع ودون امتصاص البصرية الحاضر على حد سواء، وعادة إضافة fluorophore الزائدة سوف تكون كافية لتحقيق أقصى قدر من الاستجابة FUEL. ومع ذلك، في تركيزات عالية ظواهر مثل تبريد ثابت أو الاصطدامية يمكن أن يؤدي إلى فقدان إشارة الفلورسنت. سوف إجراء سلسلة التخفيف بشكل مستقل من قبل متفاوتة تركيز مصدر الانارة وfluorophore تساعد على تحسين تركيز المطلوب. إنشاء والأمثل للوقود تحت تركيزات في الجسم الحي هو أكثر صعوبة وتحتاج إلى معالجة على أساس كل حالة على حدة. يمكن أن يكون من الصعب خلق التعاون ndition حيث يمكن الوصول إلى كيان الفلورسنت بصريا من المصدر الانارة. على هذا النحو، بدءا شارك الحقن المباشر للالأنصاف اثنين يمكن أن توفر معلومات بشأن نجاح FUEL تحت الظروف المثلى.
وجود بروتوكولات موحدة لوضع العلامات البكتيريا والخلايا حقيقية النواة مع الكيانات الفلورسنت مثل سلسلة اليكسا وQDS. وغالبا ما يتطلب هذا functionalization السطح أو التنشيط مع الأجسام المضادة، التي يمكن أن تؤدي إلى آثار غير مرغوب فيها مثل تخفيض بقاء الخلية أو تغيير النشاط الأيضي. للتغلب على هذا، فمن المهم لتحديد المبلغ الأمثل من الأجسام المضادة أو وكيل التنشيط اللازمة التي تقلل من الاضطرابات الخلوية مع تعظيم وضع العلامات الفلورية. استخدام QDS هو مفيد لما لها من أطياف واسعة مميز الإثارة والضيقة والانضباطي أطياف الانبعاثات، وإمكانية تحول كبير ستوكس. ومع ذلك، يمكن أن تكون سامة للخلايا وQDS قد لا يكون مرغوبا فيه في بعض الحالات.
<p الطبقة = "jove_content"> FUEL هو ظاهرة موجودة في العديد من التجارب بريت 13 وينطبق على مجموعة متنوعة من الانارة ومصادر الفلورسنت. حتى الآن، كانت تعتبر الفوتونات الناتجة عن الوقود المنتج من التفاعلات غير محددة أو إشارة الخلفية المؤسفة الناتجة عن سوء تصميم التجارب بريت. مع أنها ليست سوى نوع من التجارب أظهرت هنا أن كنا قادرين على تحديد مدى فائدة هذه الإشارة غير المرغوب فيها. في الأمثلة المعروضة، والبكتيريا الانارة بمثابة مصدر الإثارة منتشر قادرة على انتزاع استجابة الفلورسنت القياسية من مجموعة واسعة من الكيانات الفلورسنت. علاوة على ذلك، نظرا لبعد المسافة عمل كبيرة، وأنها آمنة لإبرام أنه في حين أن وقود يمكن بناؤها دون وقوع بريت، بريت في العام لا يمكن ملاحظتها دون مساهمة من الوقود. الأهم من ذلك، نظرا لعدم وجود شرط الاستهداف، FUEL يمكن استخدامها لتغطية الفجوة المكانية القائمة بين بريت وجتقنيات التصوير كله والحيوان onventional.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أعرب عن امتنانهم للدعم المالي من مؤسسة باستور نيويورك (دينار، CS، CS)، والاتحاد الأوروبي FP7 برنامج "أتمتة" (لSLS)، وبرنامج معهد كارنو 11 (دينار، ه ، AR، RT، SLS) ومشروع IMNOS (لRT، SLS)، ومؤسسة كوني-مافي الخيرية (SLS)، والماجستير الأوروبي في التصوير الجزيئي (لتقنية المعلومات)، وبرامج منطقة إيل دو فرانس MODEXA (SLS)، السمسم (SLS) وDimMalInf (SLS، RT)، وكالة الاستخبارات الوطنية برنامج جراند INVESTISSEMENT DE L'AVENIR البنى التحتية Nationales أون البيولوجيا-سانتي: فرنسا LifebioImaging (FLI) فرنسا الحياة التصوير (RT، SLS)، فرنسا Bioimaging (دينار، SLS) و معهد باستور في باريس. علاوة على ذلك، فإن الكتاب أود أن أشكر، خوسيه Bengoechea وهربرت شفايتزر للمواد. علاوة على ذلك، فإن الكتاب أود أن أشكر سيندي فيفر الذي ولدت الأجسام المضادة.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
| Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
| Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
| Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
| Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
| Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
| Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
| Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
| Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
| Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
| Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
| yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
| Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
| Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
| HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
| Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 | |
References
- Hu, K., et al. A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer. J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).
- Contag, C. H., et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).
- Condeelis, J., Weissleder, R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).
- Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).
- Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. 10, (2010).
- Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. Luminescent probes and visualization of bioluminescence. Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).
- Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light. Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).
- Saito, K., et al. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging. Nat Commun. 3, 1262 (2012).
- Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).
- Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. The BRET technology and its application to screening assays. Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).
- So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).
- Wu, Q., Chu, M. Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes. Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).
- Wu, C., et al. In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).
- Piston, D. W., Kremers, G. -. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
- Dragavon, J., et al. in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. , 790210-790219 (2011).
- Dragavon, J., et al. In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).
- Holland, A. D., et al. In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer. Methods. , (2013).
- Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).
- Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect Immun. 31, 71-77 (1981).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging–techniques and applications. J Microsc. 247, 119-136 (2012).
- Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).
- Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles. Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).
- Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods. Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).
