BRET歩：バインドされていない励起による蛍光発光から（燃料）

共鳴エネルギー移動（RET）が終了したドナーからのエネルギーが強い双極子-双極子相互作用13を介してアクセプターからの蛍光応答を誘導することができることにより、発光ドナーと蛍光アクセプターとの間の非放射性の相互作用である。化学発光、蛍光23,24、および生物発光ドナー13を用いて説明したRETは、主に必要とする：ドナー発光とアクセプターの励起スペクトルとの間の1強いスペクトルの重なりを; 2つのエンティティ間の適切な回転整列。と3。0.5〜2倍を超えない作動距離ドナーとアクセプター17との間のフェルスター半径R 0、。 RETとは対照的に、燃料は、生物発光細菌などの発光源は、このようなフルオロフォアまたは蛍光ナノ粒子として吸収され、第2のエンティティによって再放射される光子を放出するときに発生する赤色のシフト放出SPECTをオリジナルの発光源のラム酒。これにより、燃料はまだ集中励起を使用せずに、標準的な落射条件に似た標準の励起発光過程に従う。この証拠は、容易に、発光細菌および高度に蛍光性の量子ドットを単純に混合することによって観察することができる。 QD705は非蛍光ポリスチレン微小球コントロール（ 図1A）と比較して、溶液中にあったときにも、 ビブリオ属の存在下では、赤のシグナルの有意な増加が観察される。生物発光、本質的にアルデヒド基質、ルシフェラーゼ、およびATPを作成するために必要な構成要素は、すべての産生され、細胞質内に含まれる。さらに、酵素の発光団の生産は、細菌の細胞質（ 図1B）内で行われます。他の場所で報告されているように、細菌の内膜と外膜との間の距離は、典型的には30nmよりも25-27、有意なRETを可能にしない距離である発生する。ないエンドサイトーシスまたは取り込みの他の手段がないためだけでなく、蛍光ナノ粒子は、細菌の細胞質に交差しない。一緒に、これらの制約は、燃料は、発光細菌を蛍光ナノ粒子と混合された場合に発生する支配的な励起発光現象であることを示している。 先に示したように、FUELは、RETの範囲を超えて存在する。距離にFUEL依存性を調べるために、標準的な分光測光キュベット減少した体積は、フルオロフォア溶液を含むもの、散布のために制御することができる適切なコントロールを含む第2、および第3の新鮮な発光溶液のアリコートを含有すると共に、使用することができる。これは、中央のキュベットは、発光源からの光潜在的な汚染を減らすために、反対側の面に配置された少なくとも二つの同一の光学窓のために保存、黒色テープ又は別の不透明な材料を用いて包まれることが不可欠である。さらに、残りの2つのキュベットを行う必要があります中央キュベットのいずれかの側に等間隔に配置すること。最後に、新鮮な発光溶液は、細菌または化学発光を使用して、最大の光産生を確実にするために、各実験で使用されるべきである。適切な配置の際、希望するフィルタの下に発光信号を取得する。後者からのデータのみが示されているものの合計の光と710〜730 nmのフィルタは、この場合に使用した。各買収後、3センチメートル（ 図2）に段階的に1.0センチメートルから対面距離を増加させる。最後に、最も明るい点にすべてのデータを正規化する。ここで使用される例では、これは、発光源及びQD705を含有するキュベット間の最短距離（D = 1cm）に発生した。このアプローチを使用して、実行可能なFUEL信号は、任意の光吸収体の非存在下で、FUELは、あらゆる可能な共鳴エネルギー移動を越えた距離で起こり得ることを示唆している最終的な取得まで観察することができ、唯一の純粋に放射であると説明することができる効果。データをフィッティングすると、D -1、D -2依存性車間距離Dの関数としてのシグナルの減少を明らかにする。幾何学的な構成に応じて、コンデンサ距離依存性や点光源のための逆二乗則に前者と後者に相当する。この結果は、キュベット開口部の大きさと発光源とフルオロフォアとの間の距離が指定されていますので、我々の全体的な収集の設定と一致している。 FUELは、量子ドットに適用されるだけでなく、Alexaの系列からの蛍光マイクロスフェア（ 表2）の範囲のフルオロフォアの広い範囲を使用して観察することができるだけでなく。コントロールに匹敵するようにするために、種々のフルオロフォアの等しい濃度を使用すべきであり、ナノ粒子の総表面積（ 表1）を一定に保持。非蛍光との適切なコントロール（PSまたはPSに蛍光団とナノ粒子とを比較することにより、ポリスチレン微小球）、シグナルの有意な増加は、各エンティティの蛍光発光最大で観察される。信号の最大の相対的な増加は、蛍光発光極大、発光極大発光から最も離れた場所に発生することが見出された。これは、発光源のブロードな発光スペクトルに比べて蛍光シグナルの増加した特異性による可能性が最も高い。 2発光極大がうまく分離しなかったときは逆に、最も信頼性の低い燃料信号が検出されました。興味深いことに、識別可能な燃料信号は、ビーズ（350フルオレセイン当量）あたりに存在する蛍光体のかなりの量に起因する可能性が最も高いスペクトル差は最小限であってもイエローフェア、で発見された。ここに示す結果は、適切な条件下でFUEL iは両方の下で、より関連性の高いアプリケーションのために選択されたプローブの適合化を可能にする種々のフルオロフォアを用いて達成され得ることを示すn個の、インビトロおよびインビボ条件下で 。観察FUEL信号の有意性は、標準的両側スチューデントt検定を用いて決定した。このように、唯一のAlexa555を用い発光源と不適合であることが判明した。 FUELに標的化の影響を調査するために、ビオチン化抗体は、発光細菌およびストレプトアビジン連結された量子ドットを標的化するために使用した。これは、細菌または発光源は発光団及び対応するフルオロフォア間のRETの可能性を最小限にするのに十分な厚さの層を提供することが重要である。インキュベーションおよび非結合抗体を除去するための洗浄後、ビオチン標識された細菌は、次いで、ストレプトアビジン結合QD705または対照としての非官能QD705のいずれかに晒されて、溶液を分割し、一組は、非付着を除去するために、さらなる回の洗浄に曝さQD705。ここでは、すべての4つの条件のために、結果として得られる発光は全光線、​​490から510ナノメートル、下で観察したdは710〜730 nmのフィルタは、後者のみつのフィルタは、データ分析のために使用されるけれども。 QD705の存在は、450〜480 nmの励起および710〜730 nmの発光フィルターを使用して比較した。調査の結果、我々は解決策を洗っていない状態（ 図3）に残された赤いシフトされた信号の差がないがほとんどを発見した。この条件下で得られた蛍光シグナルはまた、QD705同数の標的化および非標的化状態の両方の下に存在することが示唆された、非常に類似していることが見出されている。ただし、未結合のQD705を削除するために、サンプルを洗浄して、その非標的対照と比較して対象となる細菌のための相対的な赤外線信号でほぼ2倍の増加を提供しています。蛍光による調査はQD705の有無を確認するために使用することができる。比較的、目標と洗浄条件は、ほぼ3倍に洗浄されていない状態よりも小さく、まだのみ減少し、得られたレッドシフトした蛍光強度が得られた30％純粋に結合した条件下で細菌の標的はレッドシフト発光の増加をもたらすことを示唆している。このことは、将来のアプリケーションを対象とした燃料の有用性を暗示。 図1の発光細菌および市販の量子ドット間FUEL相互作用が赤色光子生成の増加をもたらす。つの分光測光キュベットを、新鮮V.の100μlアリコートを含有する溶液で満たしたIVISスペクトラム取得した発光スペクトル内に配置する前1〜1.5のOD 600、PSの895μL、およびQD705または生理食塩水（PS）の5μLのどちらか、とシャリ文化。赤色シグナルの有意な増加が原因の存在のために達成されるQD705、710から730 nmの発光フィルター（A）の下で、対照と比較して秒-1•CM -2（P•秒-1•CM -2）•検出された光子の増加により注目することができるように。ここでは、細菌の二重膜は、発光部分（青丸）とQD705（黒丸）との相互作用を除外している。後者は自由にバルク溶液（B）に分布している前者のみが細菌細胞質中に見出される。各菌液用= 3、N。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 図2燃料の証拠が距離COMPLにわたって発生etely共鳴エネルギー移動を除く。光度キュベットQD70550μlの生理食塩水950μlの（PS）又は非蛍光48nmのポリスチレン微小球の97.2μlのとPSの902.8μlのいずれかを含有する溶液で満たされ、両側に等距離に配置したOD 1〜1.5の600で、新鮮な発光フォトバクテリウム属の1ミリリットルを含む中央シュバルツキュベットの。中央キュベットは放出された光子が自由に分散させることができるように2の同一の光学窓を持っていた。 1.0センチメートル〜3 cmの範囲の距離（D）で画像を取得し、赤色光の産生が観察されたFUELが共鳴エネルギー移動によって達成可能ではない距離で起こり得るという証拠を表示する距離の関数として減少した。強度は逆二乗則（左）と同様、D -2依存性を、持っているように見えた。同じプロトコルを大腸菌追跡した大腸菌 （右）。結果のトレンドラインは、コンセプトTHAにフォームを開催細菌は、光の点源として動作しているトン。三つの独立した距離測定値の合計は、それぞれが固有の継代培養を用いて得た。エラーバーは、各時点で存在している。場合によっては、エラーバーは、正規化された強さを示すために使用される記号よりも小さかった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 図3標的（特異的）および非標的（バルク溶液）FUELとの比較。K. 肺炎連鎖球菌は、ビオチン化抗体で官能化し、次いでストレプトアビジン標識（標的化）または非標識（非標的化）QD705のいずれかに曝露した。得られた溶液を均等に配当でしたDEDと1セットPBS中で最初の体積中に再懸濁する前にPBSで3回洗浄した。溶液を、次いで、黒色96ウェルプレート及び（青色バーとして示される）490〜510ナノメートル（500ナノメートル）および710〜730ナノメートル（720 nm）の発光フィルターで観察生物発光の個々のウェル中に分配した。 Pの•秒-1•センチ-2 720 nmのフィルターから検出された各ウェルについては、それぞれのP•秒-1•センチ-2同一ウェルの500nm以上の生物発光強度で規格化した。落射蛍光励起に起因する相対的な蛍光強度を450〜480 nmの励起および710〜730 nmの発光フィルター（赤色バーとして示される）を用いて決定した。生物発光または蛍光シグナルの違いはありませんがほとんどが未洗浄の条件（非標的未洗浄およびターゲット未洗浄）で観察した。これは、結合されたとフリーフローティングQD705は生物発光光子によって均等に興奮していたことを示唆している。洗濯の際に、N初期の相対的な赤外線信号で2倍の差は、対照（洗浄非標的）と比較した（対象となる洗浄した）QD705で標識された細菌が観察された。非標的洗浄中QD705の不在は、蛍光シグナルの欠如によって確認され、目標と洗浄状態にQD705ラベルを確認した。データは、Kの4独立した培養物からのものである肺炎球菌。明確にするために、伝説がQD705励起のソースを示します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 蛍光色素分子 濃度 μL PS（μL） λ マックス EX / EM（NM） 発光フィルタ（N M） アレクサ555 37.2μM 4.77 995.23 565分の555 570から590 アレクサ568 37.2μM 4.77 995.23 603分の578 590から610 アレクサ633 37.2μM 4.77 995.23 637分の632 650から670 幅：108px; ">アレクサ700 37.2μM 4.77 995.23 723分の702 710から730 非蛍光性の 2.62パーセントの固形分 9.72 990.28 μSphピンク固形分5％ 4.77 995.23 605分の580 610から630 μSphイエロー固形分5％ 4.77 995.23 515分の505 510から530 QD705 2μM 5 995 705分の465 710から730 高さ：22px;幅：108px; "> QD800 2μM 5 995 705分の465 790から810 表1燃料デモンストレーションを通じて使用される蛍光体の性質。 コントロール フィルター 蛍光色素分子 コントロール p値 P·秒-1·cm -2で SD P·秒-1·cm -2で SD A555 PS 580 1.08×10 7 3.31×10 6 9.09×10 6 1.75×10 6 0.233 A568 PS 600 8.47×10 6 4.23×10 6 4.49×10 6 9.71×10 5 0.094 A633 PS 660 2.40×10 6 1.25×10 6 7.85×10 5 2.39×10 5 0.046 A700 PS 720 5.53×10 5 2.46×10 5 1.54×10 5 <TD> 6.05×10 4 0.026 MSPHイエロー非蛍光μspheres 520 1.19×10 8 4.85×10 7 5.79×10 7 1.99×10 7 0.057 MSPHピンク非蛍光μspheres 620 2.37×10 7 1.36×10 7 2.16×10 6 8.00×10 5 0.026 QD705 非蛍光μspheres 720 1.76×10 7 7.33×10 6 2.08×10 5 7.16×10 4 0.007 QD800非蛍光μspheres 800 7.79×10 6 4.72×10 6 3.60×10 4 1.52×10 4 0.023 表2。蛍光団と燃料と互換性のある蛍光ナノ粒子の同定。