A Step Beyond BRET: Fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL)

Resonance Energy Transfer (RET) est une interaction non radiatif entre un donneur luminescent et d'un accepteur de fluorescence, grâce à quoi l'énergie du donneur sorti est capable d'induire une réponse de fluorescence de l'accepteur à travers une forte interaction dipôle-dipôle 13. RET, qui a été décrite à l'aide fluorescent 23, 24 chimioluminescence, et bioluminescentes 13 bailleurs de fonds, nécessite principalement: 1 chevauchement spectral forte entre l'émission du donneur et accepteur spectres d'excitation;. 2 alignement de rotation appropriée entre les deux entités.; et 3. une distance de travail non supérieure à 0,5 à 2 fois le rayon de Förster, R 0, entre le donneur et l'accepteur 17. Contrastant avec RET, FUEL se produit lorsqu'une source luminescent, tel que des bactéries bioluminescentes, émet un photon qui est absorbée et réémise par une seconde entité, tel qu'un fluorophore ou une nanoparticule fluorescente rouge de décalage d'émission le spectrhum de la source luminescente initiale. Ainsi, FUEL suit un processus d'excitation-émission-type semblable à épifluorescence conditions standards, mais sans l'utilisation d'une excitation focalisé. La preuve de cela peut être facilement observé par le simple mélange de bactéries luminescentes et les points quantiques fortement fluorescentes. En présence de la Vibrio sp, une augmentation significative des signaux rouge est observée lorsque QD705 étaient également en solution par rapport à un contrôle non-fluorescente à base de microsphères de polystyrène (Figure 1A). Les composants nécessaires pour créer la bioluminescence, essentiellement du substrat en aldéhyde, la luciférase et l'ATP, sont tous produits et contenus à l'intérieur du cytoplasme. En outre, la production enzymatique de luminophore a lieu dans le cytoplasme bactérien (figure 1B). Comme il a été rapporté ailleurs, la distance entre la membrane interne et externe des bactéries est généralement supérieure à 30 nm 25 à 27, sur une distance qui ne permet pas significative pour RETde se produire. De plus, les nanoparticules fluorescentes ne se croisent pas dans le cytoplasme bactérien puisqu'il n'y a pas d'endocytose ou d'autres moyens de fixation. Ensemble, ces contraintes indiquent que le carburant est le phénomène d'excitation-émission dominante qui survient lorsque les bactéries luminescentes sont mélangés avec des nanoparticules fluorescentes. Comme on l'a déjà montré, FUEL existe au-delà de la gamme de RET. Pour étudier la dépendance de carburant sur la distance, standards cuves spectrophotométriques de volume réduit peuvent être utilisés, avec un contenant une solution de fluorophore, un second contenant un contrôle approprié qui peut contrôler les points, et la troisième contenant un aliquote de solution luminescente frais. Il est essentiel que la cuvette centrale est enveloppée à l'aide du ruban noir ou en un autre matériau opaque, sauf pour au moins deux fenêtres optiques identiques situés sur des faces opposées, afin de réduire la contamination potentielle de la lumière provenant de la source luminescente. En outre, les deux cuves restantes doiventêtre placé de manière équidistante sur chaque côté de la cuvette centrale. Enfin, une solution luminescente frais, à l'aide de bactéries ou de chimioluminescence, doit être utilisé avec chaque expérience pour assurer une production maximale de la lumière. Lors d'un placement approprié, acquérir le signal de luminescence dans les filtres souhaités. La lumière totale et 710-730 nm filtres ont été utilisés dans ce cas, bien que seules les données de ce dernier sont affichés. Après chaque acquisition, augmenter progressivement la distance face-à-face de 1,0 cm à 3 cm (figure 2). Enfin, normaliser toutes les données à la point le plus lumineux. Dans les exemples utilisés ici, cela s'est produit à la plus courte distance (D = 1 cm) entre la source luminescente et la cuve contenant la QD705. En utilisant cette approche, le signal de FUEL viable peut être observée jusqu'à l'acquisition définitive ce qui suggère que, en l'absence de toute absorption optique, FUEL peut se produire à des distances au-delà de tout transfert possible d'énergie de résonance et ne peut être expliqué pour être purement radiatifeffet. Montage de données révèle une diminution du signal en fonction de la distance D suivant un D-1 à D de la dépendance. En fonction de la configuration géométrique, la première correspond à la dépendance condensateur à distance et la seconde à la loi du carré inverse de sources ponctuelles. Ce résultat est donc conforme à notre configuration globale d'acquisition, étant donné la taille de l'ouverture de la cuvette et de la distance entre la source luminescente et le fluorophore. FUEL s'applique non seulement à des points quantiques, mais peut aussi être observée en utilisant une large gamme de fluorophores allant de la série de microsphères fluorescentes Alexa (tableau 2). Pour être comparable au témoin, des concentrations égales des fluorophores différents doivent être utilisés et l'aire totale de la surface des nanoparticules maintenus constants (tableau 1). En comparant les fluorophores et des nanoparticules de leurs contrôles appropriés (PS ou PS avec les non-fluorescentmicrosphères de polystyrène), une augmentation significative de signal est observé à un maximum d'émission de chaque entité fluorescente. L'augmentation relative plus importante dans le signal a été trouvé à se produire lorsque le maximum d'émission de fluorescence a été le plus éloigné du maximum d'émission de luminescence. Ceci est probablement dû à l'augmentation de la spécificité du signal fluorescent par rapport au large spectre d'émission de la source luminescente. Au contraire, le signal de FUEL moins fiable a été constaté lorsque les maxima d'émission de deux n'étaient pas bien séparés. Fait intéressant, un signal de FUEL discernable n'a été trouvée avec les microsphères jaunes, même si la différence spectrale est minimale, due très probablement à la quantité importante de la présente fluorophore par bille (350 équivalents de fluorescéine). Les résultats présentés ici indiquent que dans des conditions appropriées carburant peut être réalisée avec une variété de fluorophores, ce qui permet l'adaptation des sondes choisies pour des applications plus pertinentes dans les deux in vitro et dans des conditions in vivo. La signification du signal de FUEL observée a été déterminée à l'aide du test t de norme Student bilatéral. En tant que telle, seule la Alexa555 a été jugée incompatible avec la source luminescente utilisée. Afin d'explorer les effets de ciblage sur le carburant, des anticorps biotinylés ont été utilisés pour cibler des bactéries luminescentes et les points quantiques de streptavidine liée. Il est important que les bactéries ou les source de luminescence assurent une couche assez épaisse pour réduire au minimum la possibilité de RET entre le luminophore et le fluorophore correspondant. Après incubation et lavage pour éliminer les anticorps non liés, les bactéries marquées à la biotine sont ensuite exposées soit QD705 de la streptavidine conjuguée ou QD705 non fonctionnalisé en tant que témoin, les solutions séparées et un ensemble exposé à des lavages supplémentaires, afin de supprimer tout non respectées QD705. Ici, pour les quatre conditions, la luminescence résultant a été observé sous la lumière totale, 490-510 nm, uned 710-730 nm filtres, mais seuls les deux derniers filtres sont utilisés pour l'analyse de données. La présence de la QD705 a été comparée à l'aide de 450 à 480 nm d'excitation et de filtres d'émission de 710 à 730 nm. Après enquête, nous avons trouvé peu ou pas de différence dans le signal décalé vers le rouge lorsque les solutions ont été laissés dans un état ​​non lavé (Figure 3). Le signal de fluorescence résultante sous cette condition se trouve également tout à fait similaire, ce qui suggère que d'un nombre égal de QD705 était présent sous la fois l'état ciblée et non ciblée. Cependant, le lavage des échantillons pour éliminer toute QD705 non lié prévoit une augmentation de près du double du signal rouge par rapport aux bactéries ciblées par rapport à leur contrôle non ciblée. Investigation par fluorescence peut être utilisée pour vérifier la présence ou l'absence de la QD705. Comparativement, l'état lavé ciblée a donné lieu à une intensité de fluorescence qui était près de trois fois moins que la condition non lavé, mais le décalage vers le rouge résultant diminué que de30%, ce qui suggère que dans des conditions strictement liées au ciblage des bactéries se traduira par une augmentation de l'émission décalée vers le rouge. Cela implique fortement l'utilité de FUEL ciblé pour les applications futures. Figure 1. Une interaction entre les bactéries luminescentes FUEL et disponibles dans le commerce points quantiques conduit à une augmentation de la production de photons rouge. Deux cuves spectrophotométriques ont été remplis avec des solutions contenant 100 aliquotes de V. frais fischeri culture avec une DO600 de 1 à 1,5, 895 ul de PS, et soit 5 ul de solution saline physiologique ou QD705 (PS), avant d'être placé dans un spectre IVIS et le spectre d'émission acquis. Une augmentation significative des signaux rouge est obtenue grâce à la présence dela QD705, comme on peut le constater par l'augmentation de photons détectés • • s -1 cm -2 (p • • s -1 cm -2) par rapport à la commande sous le filtre d'émission 710-730 nm (A). Ici, la double membrane de la bactérie exclut l'interaction des groupements luminescents (cercles bleus) et la QD705 (cercles noirs). Le premier ne se trouvent que dans le cytoplasme bactérien alors que ce dernier est distribué librement dans la solution en vrac (B). N = 3 pour chaque solution bactérienne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Trace de carburant se produisant sur ​​des distances complà l'exclusion etely transfert d'énergie de résonance. cuves spectrophotométriques ont été remplis avec des solutions contenant soit 50 ul de QD705 et 950 ul de solution saline physiologique (PS) ou 97,2 pi de non-fluorescentes microsphères 48 nm de polystyrène et de 902,8 ul de PS, et placées de manière équidistante sur des côtés opposés d'une cuvette noir central contenant 1 ml de frais luminescente Photobacterium sp à une DO 600 de 1-1,5. La cuvette centrale avait deux fenêtres optiques identiques permettant aux photons émis pour disperser librement. Acquisition d'images à des distances (D) allant de 1,0 cm à 3 cm, la production observée de la lumière rouge a diminué en fonction de la distance l'affichage des preuves que le carburant peut se produire à des distances pas réalisables par transfert d'énergie de résonance. L'intensité semble avoir D de la dépendance, similaire à la loi du carré inverse (à gauche). Le même protocole a été suivi pour E. coli (à droite). Les lignes de tendance résultant détiennent forme au concept that les bactéries agissent comme des sources ponctuelles de lumière. Un total de trois mesures de distance indépendantes entre elles ont été acquises en utilisant une sous-culture unique. Les barres d'erreur sont présents à chaque point. Dans certains cas, les barres d'erreur sont plus petites que les symboles utilisés qui indiquent l'intensité normalisée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. Une comparaison entre ciblée (spécifique) et non ciblée (solution globale) CARBURANT. K. pneumoniae ont été fonctionnalisées avec des anticorps biotinylés et ensuite exposé à de la streptavidine marquée, soit (ciblé) ou non marquée (non ciblées) QD705. Les solutions résultantes sont également divided et une série lavées trois fois avec du PBS avant d'être remises en suspension dans leur volume initial dans du PBS. Les solutions ont ensuite été distribués dans les puits individuels d'une plaque de 96 puits noir et la bioluminescence observée dans les filtres d'émission 490-510 nm (500 nm) et 710-730 nm (720 nm) (indiqués par des barres bleues). Le p • • s -1 cm -2 trouve de filtre de 720 nm pour chaque puits a été normalisée par le respectif p • • s -1 cm -2 intensité de bioluminescence de 500 nm de la même bien. L'intensité relative de fluorescence résultant de l'excitation à fluorescence a été déterminée à l'aide de 450 à 480 nm d'excitation et de filtres d'émission de 710 à 730 nm (indiqué par des barres rouges). Peu ou pas de différence dans le signal de bioluminescence ou fluorescent a été observée dans les conditions non lavées (non-ciblées non lavés et non lavés ciblées). Ceci suggère que la QD705 lié et libre-flottante étaient tout aussi excités par les photons bioluminescentes. Après le lavage, le ntôt une différence de deux fois dans le signal rouge par rapport a été observée pour les bactéries QD705 marqués (ciblées lavés) par rapport à la commande (non ciblée lavé). L'absence de QD705 dans le non-ciblée lavé a été confirmée par l'absence de signal fluorescent et vérifié l'étiquetage de QD705 dans l'état lavé ciblée. Les données sont de quatre cultures indépendantes de K. pneumoniae. Par souci de clarté, la légende indique la source de l'excitation de QD705. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Fluorophore Concentration pl PS (ul) λ max ex / em (nm) Filtre d'émission (n m) Alexa 555 37,2 uM 4,77 995,23 555/565 570-590 Alexa 568 37,2 uM 4,77 995,23 578/603 590-610 Alexa 633 37,2 uM 4,77 995,23 632/637 650-670 largeur: 108px; "> Alexa 700 37,2 uM 4,77 995,23 702/723 710-730 Nonfluorescent 2,62% de matière sèche 9,72 990.28 μSph rose 5% de matières solides 4,77 995,23 580/605 610-630 μSph jaune 5% de matières solides 4,77 995,23 505/515 510-530 QD705 2 uM 5 995 465/705 710-730 hauteur: 22px; largeur: 108px; "> QD800 2 uM 5 995 465/705 790-810 Tableau 1. Propriétés des fluorophores utilisés dans les démonstrations de carburant. Contrôle filtre fluorophore Contrôle valeur de p p · s -1 · cm -2 Dakota du Sud p · s -1 · cm -2 Dakota du Sud A555 PS 580 1,08 x 10 7 3,31 x 10 6 9,09 x 10 6 1,75 x 10 6 0,233 A568 PS 600 8,47 x 10 6 4,23 x 10 6 4,49 x 10 6 9,71 x 10 5 0,094 A633 PS 660 2,40 x 10 6 1,25 x 10 6 7,85 x 10 5 2,39 x 10 5 0,046 A700 PS 720 5,53 x 10 5 2,46 x 10 5 1,54 x 10 5 <td> 6,05 x 10 4 0,026 MSPH jaune μspheres non fluorescents 520 1,19 x 10 8 4,85 x 10 7 5,79 x 10 7 1,99 x 10 7 0,057 MSPH rose μspheres non fluorescents 620 2,37 x 10 7 1,36 x 10 7 2,16 x 10 6 8,00 x 10 5 0,026 QD705 μspheres non fluorescents 720 1,76 x 10 7 7,33 x 10 6 2,08 x 10 5 7,16 x 10 4 0,007 QD800 μspheres non fluorescents 800 7,79 x 10 6 4,72 x 10 6 3,60 x 10 4 1,52 x 10 4 0,023 Tableau 2. Identification des fluorophores et des nanoparticules fluorescentes compatible avec le carburant.