Için bir Basit Işık Formu Mikroskop Kurma<em> Toto yılında</em> Gürüntülenmesi<em> C. elegans</em> Gelişme
Summary
Bu protokol, bir ışık mikroskobu tabaka setup ve C in vivo görüntüleme için uygulanmasını açıklamaktadır elegans embriyolar.
Abstract
Hızlı ve düşük fototoksik görüntüleme teknikleri toto organizmaların gelişimini incelemek için ön koşul vardır. Subsellüler çözünürlükte 3D görüntüler sunarken, hafif levha bazında mikroskopisi, foto-ağartma ve konfokal mikroskopi göre fototoksik etkilerini azaltır. Burada dik bir mikroskop ve ışık tabakanın oluşturulması için opto-mekanik elemanlarının küçük bir set oluşan bir ışık mikroskobu bazlı tabaka, bir kurulum mevcut. Protokol, inşa mikroskop hizalayın ve ışık tabakası karakterize anlatılmaktadır. Buna ek olarak, C toto görüntüleme yöntemini uygulamak için nasıl ayrıntıları elegans basit bir gözlemi odacığı kullanılarak embriyolar. Yöntem geliştirme birkaç saatten fazla 3D iki-renk time-lapse film yakalama sağlar. Bu uzun süre üzerinde hücre şekli, hücre bölünmeleri ve etiketli proteinlerin izleme kolaylığı olmalıdır.
Introduction
Bir organizmanın oluşumu ve şekillendirme hücre hareketleri, hücre şekli değişiklikleri, hücre bölünmesi ve hücre farklılaşması içerir. Bu süreçlerin ilerlemesini ve koordinasyonunu Anlamak üç boyut özelliği ve subsellüler çözünürlüğü ile hızlı görüntüleme araçları gerektirir. Bu in vivo görüntüleme yetenekleri ile teknikler arasında, hafif levha aydınlatma mikroskobu da tek / seçici düzlem aydınlatma mikroskopisi adlandırılan düşük fototoksik etkilerini ve 1,2 düşük ışıkla üreten benzersiz bir avantaja sahiptir.
Tabaka aydınlatma mikroskopi, numune optik kesit yerine hafif bir levha ile taraftan aydınlatılır. Aydınlatma yolu ve algılama yol birbirine dik olan ve ışık tabaka algılama objektif lens nesne odak düzlemi denk hizalanır. Numune, iki yol kesiştiği yerleştirilen birnd 3D görüntü sağlamak için algılama ekseni boyunca hareket ettirilebilir. Ilgi sadece düzlemi aydınlatılır ve bu düzlemin tüm noktalar aynı anda tespit edilir. Bu durum elde etme hızını artırır ve konfokal mikroskopi 3 ile karşılaştırıldığında, photobleaching hem de fototoksisite azaltır.
Iki boyutlu görüntüleme için, herhangi bir tarama algılama kısmı için, ne de aydınlatma kısmı için ne gereklidir;: Pratik olarak, sac aydınlatma mikroskopisi kurulum ve uyum sağlamaya kolaydır yeteneği kesit ile bir geniş alan teknik olarak, üç boyutlu görüntü örnek tutma aşamasının, bir tek eksenli bir hareket ile elde edilebilir.
Burada C toto görüntüleme için basit bir ışık mikroskobu levha ve uygulama kurulmasını sunmak elegans embriyolar. C. elegans embriyolar de in vivo ima yaşamak için uygundurOnların şeffaflığı nedeniyle Ging, değişmeyen soy ve hücre basmakalıp, 4,5 konumlandırır. Geliştirilen ışık tabaka ayar tespit edilmesi için standart bir dik bir mikroskop dayanmaktadır. Aşağıda sunulan protokol oluşturmak ve hizaya uyarma modülü / yolunu, testi ve ışık tabakası karakterize ve 3D görüntüleme için örnek monte etmek nasıl ayrıntıları. Ayrıca floresan belirteçlerin ifade çeşitli cinsler üzerinde kurulum ile edinilen time-lapse film örnekleri sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol C. in vivo görüntüleme için ışık sac mikroskobu kolay bir kurulum açıklar elegans embriyolar. Lazerler, ışın genişletici, kolimasyonu ve odaklanma lensler de dahil olmak üzere ışık tabakası oluşturmak ve uyum için gerekli optik elemanlar, kolayca bir optik tezgah üzerine monte edilebilir. Algılama yolu ve kamera için dik bir mikroskop ile birlikte, bu kurulum için basit bir çözüm, bir ışık mikroskobu tabaka sağlar.
Bu geometri örnek çevre basit yapar. Canlı numune düzenlenen yerleştirilmiş ve mekanik parçaları küçük bir set ile hareket eden bir cam küvet içinde yerleştirilir. Tabaka aydınlatma mikroskobu yeteneği kesit ile geniş alan teknik olduğu için, yalnızca tek bir eksen motorlu hareket 3D görüntüleme için gereklidir. Bu, tek bir tarama elemanı senkronizasyon ihtiyacı sınırlar ve yazılım geliştirilmesini kolaylaştırır. ISPIM 6 bizim dik geometrik karşılaştırıldığındary tespiti için yüksek NA objektif lens kullanımına izin verir. Yatay düzlemde objektifler ile SPIM kurulumları ile karşılaştırıldığında numune montaj ve embriyonun bir dizi görüntü daha kolaydır. Toplamda, bu tekniğin uygulanması basittir ve optik az uzmanlık ile elde edilebilir. Bu yüksek hız ve düşük fototoksisite ancak daha düşük eksenel kararı dezavantajı avantajları ile konfokal mikroskoplar için ucuz bir alternatif olduğunu.
Ayrıca C montaj için kolay ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdi Bu sistemi kullanarak in vivo görüntüleme için elegans embriyolar. Montaj prosedürü hızlıdır (15 dakika) ve günlük deneyler için de uygundur. C. için elegans görüntüleme, bu basit kurulum avantajları en az iki-kıvrımlar vardır: toto görüntüleme (i) rotasyon olmadan mümkün değildir ve bu nedenle 3 boyutlu rekonstrüksiyon basittir; (Ii) örnek montaj kolay ve birden fazla embriyoların sırayla görüntülenebilirAynı slaytta. Biz hücre bölünmeleri ve hücre şekil değişiklikleri gözlemlemek için yeterli zamansal çözünürlüğe sahip time-lapse film örnekler gösterdi. C çalışma ışık sac mikroskobu gücü elegans gelişme yakın zamanda diğerleri 6, 7, 8 ile izah edilmiştir. Dolayısıyla, bu teknik, C morfojenezini ve model çalışma için çok yararlı olacaktır elegans embriyo.
Bu sistem aynı zamanda diğer model organizmaların gelişimini analiz etmek için kullanılabilir? Bu, kabul edilmesi önemlidir ki, C gibi küçük ve şeffaf bir organizma için tabaka aydınlatma mikroskobu uygulanması elegans Drosophila embriyolar gibi daha büyük canlılar için daha az katıdır. Drosophila toto görüntülemede normal rotasyon ve multi-view rekonstrüksiyon 9, 10. kolineer uyarma objektif lens ile iki taraftan Uyarımı'nı da attenuat neden gölge etkileri azaltılmış olabilir gerektirirIşık 11 iyon. Yine, burada sunulan kurulum hala düşük ağartma ve düşük photoxicity ile, Drosophila embriyoların görüntü bir tarafına şekilde uyarlanmıştır. Bu kurulum aynı zamanda ascidians veya zebrabalıkları gibi görüntü küçük ve şeffaf embriyolar için yararlı olabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz tartışma için yazılım geliştirme ve Jérémie CAPOULADE özellikle Olivier Blanc, tüm Lenne üyeleri ve Bertrand laboratuarları teşekkür ederim. Biz de teknik destek için PICsL-IBDM görüntüleme tesisi, özellikle Claude Moretti ve Brice Detailleur teşekkür ederim.
Bu çalışma (P.-FL ve VB) CNRS dan ATIP hibe tarafından desteklenen, Labex (VB) Sanofi-Aventis gelen ve bir hibe (P.-FL ve VB) hibe INFORM. Biz (ANR-10-InSb-04-01 "INVESTISSEMENTS d'Avenir" diyoruz) Agence Nationale de la Recherche tarafından desteklenen Fransa-Biolmaging altyapısını kabul.
Materials
| SPIM | |||
| Detection | |||
| upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
| 100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
| EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
| Illumination | |||
| LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
| filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
| Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
| Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
| AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
| mirror | |||
| lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
| lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
| periscope | THORLABS | RS99/M | |
| cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
| 10X NA 0,3 | NIKON | ||
| xyz stage | NEWPORT | ||
| Sample | |||
| Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
| Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
| Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
| M9 medium: | |||
| KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
| Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
| NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
| MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
| cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
| sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
| x stage | NEWPORT | ||
| coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
| piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
| cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
| Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
| Software | |||
| C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |
References
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136, 1963-1975 (2009).
- Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP J. 2, 266-275 (2008).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
- Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).
- Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139, 4271-4279 (2012).
- Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens. Cell. 151, 1370-1385 (2012).
- Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9, 730-733 (2012).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM). Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).
