إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل<em> في توتو</em> التصوير من<em> C. ايليجانس</em> التنمية
Summary
يصف هذا البروتوكول الإعداد المجهر رقة الضوء وتنفيذها لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة.
Abstract
تقنيات التصوير الضوئية سريعة ومنخفضة هي شرط مسبق لدراسة تطوير الكائنات جملة وتفصيلا. المجهر ضوء ورقة تستند يقلل الصورة تبيض والتأثيرات الضوئية مقارنة المجهري متحد البؤر، مع توفير صور 3D مع قرار التحت خلوية. هنا نقدم الإعداد من ورقة القائمة على ضوء المجهر، التي تتألف من المجهر تستقيم ومجموعة صغيرة من عناصر البصريات الميكانيكية لتوليد ضوء ورقة. يصف البروتوكول كيفية بناء ومحاذاة المجهر وتميز ورقة الخفيفة. بالإضافة إلى ذلك، أنها تبين بالتفصيل كيفية تنفيذ أسلوب في التصوير جملة وتفصيلا من C. ايليجانس أجنة باستخدام غرفة الملاحظة البسيطة. الأسلوب يسمح للأسر 3D-ونين الأفلام الوقت الفاصل بين أكثر من ساعات قليلة من التنمية. وهذا ينبغي أن تخفف من تتبع شكل الخلية، انقسامات الخلية والبروتينات الموسومة على مدى فترات طويلة من الزمن.
Introduction
تشكيل وصياغة كائن حي ينطوي على تحركات الخلية، ويتغير شكل الخلية، وانقسام الخلايا وتمايز الخلايا. فهم تطور وتنسيق هذه العمليات تتطلب أدوات التصوير السريع مع القدرة على ثلاثة أبعاد وقرار التحت خلوية. من بين التقنيات مع هذه في الجسم الحي قدرات التصوير، ودعا ضوء ورقة واحدة أيضا إضاءة المجهر / انتقائية الإضاءة الطائرة المجهر لديه ميزة فريدة من نوعها لإنتاج تأثيرات المنخفض الضوئية وانخفاض photobleaching من 1،2.
في ورقة إضاءة المجهر، مضاءة العينة من الجانب بواسطة ورقة الضوء، الذي يؤدي وباجتزاء البصرية. المسار الإضاءة ومسار الكشف هي متعامدة مع بعضها البعض، ويتم محاذاة الورقة الضوء ليتزامن مع المستوى البؤري كائن الكشف عدسة الهدف. يتم وضع العينة عند تقاطع المسارين، والثانية يمكن نقلها على طول محور الكشف للسماح 3D التصوير. يضيء فقط الطائرة من الاهتمام ويتم الكشف عن جميع النقاط من هذه الطائرة في نفس الوقت. هذا يزيد بشكل كبير من سرعة اكتساب ويقلل photobleaching من الضيائية وكذلك بالمقارنة مع المجهري متحد البؤر 3.
عمليا، والإضاءة ورقة المجهر هو سهل الإعداد ومحاذاة: للتصوير ثنائي الأبعاد، لا المسح ضروري لا بالنسبة للجزء الكشف، ولا بالنسبة للجزء الإضاءة؛ كأسلوب واسعة المجال مع باجتزاء القدرة، ويمكن الحصول على تصوير ثلاثي الأبعاد من قبل حركة محور واحد من مرحلة عقد العينة.
نحن هنا تقديم إقامة المجهر ضوء ورقة بسيطة وتنفيذها لفي التصوير جملة وتفصيلا من C. ايليجانس الأجنة. C. هي مناسبة بشكل جيد ايليجانس الأجنة في العيش في فيفو معهد العالم العربيجينج بسبب شفافيتها، النسب ثابتة ونمطية خلية مواقف 4،5. ويستند إعداد ورقة وضعت على ضوء المجهر تستقيم القياسية للكشف. بروتوكول المعروضة أدناه تفاصيل كيفية بناء ومحاذاة الإثارة وحدة / المسار واختبار وتميز ورقة الضوء وجبل العينة للتصوير 3D. كما يوفر أمثلة من الأفلام مرور الزمن اكتسب مع الإعداد على سلالات مختلفة معربا عن علامات الفلورسنت.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسهلة الإعداد المجهر ضوء ورقة لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة. العناصر البصرية الضرورية لإنشاء ومحاذاة الورقة الضوء، بما في ذلك أشعة الليزر، وشعاع المتوسع، إيزاء وعدسات التركيز، ويمكن تركيبه بسهولة على مقاعد البدلاء البصرية. في تركيبة مع المجهر تستقيم لمسار كشف والكاميرا، وهذا يوفر حلا بسيطا لإعداد ورقة المجهر الخفيفة.
هذه الهندسة يجعل البيئة عينة بسيطة. يتم وضع العينة يعيشون في كوفيت الزجاج، والذي يقام المتمركزة وانتقلت من مجموعة صغيرة من القطع الميكانيكية. كما الإضاءة رقة المجهري هو أسلوب حقل واسع مع باجتزاء القدرة، مطلوب فقط محور واحد آلية الحركة للتصوير 3D. وهذا يحد من شرط التزامن إلى عنصر واحد المسح الضوئي ويسهل تطوير البرمجيات. مقارنة iSPIM 6 دينا geomet تستقيمراي يسمح باستخدام عدسة الهدف NA عالية للكشف. مقارنة مع الاجهزة SPIM مع العدسات الهدف في المستوى الأفقي وتركيب العينة والتصوير من سلسلة من الأجنة هي أسهل. تماما، وتنفيذ هذه التقنية واضحة ومباشرة، ويمكن أن يتحقق مع القليل الخبرة في مجال البصريات. هذا هو بديل أرخص لالمجاهر مبائر مع مزايا أعلى سرعة وانخفاض الضيائية ولكن العيب قرار المحوري أقل.
نحن أيضا تطوير وسيلة سهلة وقابلة للتكرار لجبل C. الأجنة ايليجانس لفي الجسم الحي التصوير باستخدام هذا النظام. الإجراء تصاعد سريع (15 دقيقة) وغير مناسبة لإجراء التجارب اليومية. لC. ايليجانس التصوير، ومزايا هذا الإعداد بسيطة ما لا يقل عن اثنين من طيات: (ط) في التصوير توتو هو ممكن من دون دوران، وبالتالي إعادة الإعمار 3D واضح وصريح؛ (ب) عينة من السهل تركيب والأجنة متعددة ولا يمكن تصوير بالتسلسلعلى نفس الشريحة. أظهرنا أمثلة من الأفلام الوقت الفاصل بين لقرار الزمنية كافية لمراقبة انقسامات الخلية ويتغير شكل الخلية. قوة المجهر ضوء ورقة لدراسة C. التنمية ايليجانس كما تم توضيح مؤخرا من قبل الآخرين 6، 7، 8، ولذلك فإن هذا الأسلوب أن تكون مفيدة جدا لدراسة التشكل والزخرفة من C. ايليجانس الجنين.
يمكن لهذا النظام أيضا أن تستخدم لتحليل تطور الكائنات نموذج آخر؟ من المهم أن ندرك أن تنفيذ ورقة إضاءة المجهر لكائن صغير وشفافة مثل C. ايليجانس أقل صرامة من لكائنات أكبر مثل أجنة ذبابة الفاكهة. في التصوير جملة وتفصيلا من ذبابة الفاكهة يتطلب عادة التناوب ومتعددة بغية إعادة بناء 9، 10. الإثارة من الجانبين مع خط واحد العدسات الهدف الإثارة يمكن أيضا تقليل تأثيرات الظل الناجمة عن attenuatايون الضوء 11. حتى الآن، والإعداد المقدمة هنا لا تزال تتكيف مع الجانب صورة واحدة من أجنة ذبابة الفاكهة، مع انخفاض تبيض وانخفاض photoxicity. هذا الإعداد يمكن أن تكون مفيدة لصورة أجنة صغيرة وشفافة مثل المزقييات أو الزرد أيضا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جميع أعضاء Lenne ومختبرات برتراند، ولا سيما اوليفييه بلان لتطوير البرمجيات وجيريمي Capoulade للمناقشة. نشكر أيضا مرفق التصوير PICsL-IBDM، ولا سيما كلود موريتي وبرايس Detailleur للدعم التقني.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من ATIP CNRS (لP.-FL وVB)، وLabex إنفورم منحة (لP.-FL وVB) ومنحة من شركة سانوفي أفنتيس (لVB). نحن نعترف البنية التحتية فرانس BioImaging بدعم من الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR-10-INSB-04-01، والدعوة "INVESTISSEMENTS كوت أفينير").
Materials
| SPIM | |||
| Detection | |||
| upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
| 100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
| EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
| Illumination | |||
| LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
| filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
| Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
| Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
| AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
| mirror | |||
| lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
| lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
| periscope | THORLABS | RS99/M | |
| cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
| 10X NA 0,3 | NIKON | ||
| xyz stage | NEWPORT | ||
| Sample | |||
| Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
| Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
| Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
| M9 medium: | |||
| KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
| Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
| NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
| MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
| cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
| sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
| x stage | NEWPORT | ||
| coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
| piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
| cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
| Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
| Software | |||
| C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |
References
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136, 1963-1975 (2009).
- Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP J. 2, 266-275 (2008).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
- Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).
- Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139, 4271-4279 (2012).
- Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens. Cell. 151, 1370-1385 (2012).
- Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9, 730-733 (2012).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM). Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).
